摘要
CRISPR/Cas9是对靶向基因进行特定DNA修饰的基因编辑技术.基于其设计简单、成本较低和效率较高等优点,在哺乳动物中已被广泛应用于基因功能研究.在鱼类中,CRISPR/Cas9技术多用于模式鱼及淡水鱼类中基因的敲除,从而对基因的功能进行研究,而在海水鱼类特别是鲆鲽鱼类中相关研究还较少.牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖鱼类,具有较高的经济价值.本研究首先在低浓度条件下(Cas9 message RNA(mRNA)和向导RNA(guide RNA,gRNA)浓度分别为250和100 ng/μL)对牙鲆肌肉发育相关基因肌分化因子(myogenic differentiation,myod)和性腺分化与发育相关基因接头相关蛋白复合物3(adaptor-related protein complex 3,ap3)、脊椎蛋白1(R-spondin 1,rspo1)及轴丝动力蛋白轻中链1(dynein axonemal light intermediate chain 1,dnali1)(dnali1-part A和dnali1-part B)基因进行编辑,其中,dnali1-part A和dnali1-part B各设计2个gRNA位点,其余基因均设计1个.结果显示,rspo1、myod及dnali1-part A编辑实验鱼苗中均未检测到突变体,ap3基因突变率小于14.3％,而dnali1-part B突变率约为42.9％～45％.提高注射浓度至Cas9 mRNA 1500 ng/μL和gRNA 1000 ng/μL后,dnali1-part B突变率提高至65％.同时,单个个体检测的突变率也由10％～20％提升至80％～90％.进一步用高浓度条件对牙鲆原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)标志基因dead end(dnd)、两性mab-3转录因子1(doublesex and mab-3 related transcription factor 1,dmrt1)和17β 羟类固醇脱氢酶1(hydroxysteroid(17-beta)dehydrogenase 1,17β-Hsd1)基因(2个gRNA)进行编辑,初孵仔鱼检测的各基因突变效率均为60％～80％.研究结果表明,低浓度条件下1个gRNA位点的基因编辑效率较低,仅为14.3％～45％,而高浓度下2个gRNA位点的基因编辑效率明显提高,可达60％～80％.本研究初步建立了牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑方法,并为其在鲆鲽鱼类中的应用提供参考.
国家科技期刊平台
NSTL
维普
万方数据