摘要
类黄酮-3'-羟化酶(flavonoid-3'-hydroxylase,F3'H)作为花青素合成路径第二阶段的关键酶,在花色苷的合成途径中至关重要.为探究F3'H在山葡萄(Vitis amurensis)花色苷形成中的作用机理,本研究以山葡萄品种'双红'为材料克隆得到F3'H基因及其启动子序列,对其进行了生物信息学和原核表达分析,并以F3'H基因不同长度缺失片段启动子转化烟草(Nicotiana tabacum)叶片进行瞬时表达.结果显示,F3'H基因ORF全长1530 bp,启动子序列长1051 bp.生物信息学分析发现,'双红'与'双丰'品种相比较,F3'H'的等电点、分子量和二级结构组成上有所差异.启动子顺式作用元件预测显示,启动子序列中除具有核心启动子元件CAAT-box和TATA-box外,还有光响应元件及一系列与逆境胁迫、激素调节相关的元件.不同长度缺失片段启动子转化烟草叶片的瞬时表达结果显示,F3'H启动子随着缺失片段启动子长度的增加,GUS酶活性呈现上升的趋势.通过原核表达载体的构建发现,F3'H重组蛋白在条件分别为温度30℃,培养时间11 h,异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)浓度0.8 mmol/L的条件下,目的蛋白在上清液样品均中有与预测重组蛋白相对分子质量大小一致且较高浓度的表达带.本研究可为后续深入研究山葡萄F3'H基因在花色苷合成过程中的调控机理及启动子转录作用机理提供基础资料.
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