摘要
几丁质酶(chitinase,CHI)是一类能降解几丁质底物、生成几丁寡糖或N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,GlcNAc)的糖苷水解酶.本研究从苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringensis)中克隆获得几丁质酶基因BtCHI1,利用大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)plysS进行异源表达,研究重组蛋白的酶学性质、多底物动力学和底物降解性质.结果显示,重组BtCHI1蛋白的分子量约为75 kD,最适反应温度和pH分别为40℃和7.0.该酶热稳定性较差,在50℃下处理1h后仅能保留20.11％残余活性;但pH稳定性较好,在pH 3.0～10.0范围内处理1 h后,残余活性均超过80％.底物动力学分析显示,重组蛋白BtCHI1能有效降解几丁质、胶体几丁质和壳聚糖,Vmax分别为(4.62±0.46)、(0.52±0.03)和(0.22±0.02)μmol/(min·mg);而BtCHI1对羟丙基壳聚糖和乙二醇几丁质则无降解作用.此外,0.5～10mmol/L的Na+、Al3+或EDTA对酶活性无影响(P＞0.05),但经0.5～10 mmol/L Ca2+或5～10 mmol/L SDS处理1 h后,酶活性显著下降(P＜0.01).薄层色谱和高效液相色谱分析显示,该酶能从几丁质和胶体几丁质底物中释放几丁二糖,并将其进一步降解为单糖.之后,将重组BtCHI1用于降解天然虾、蟹壳底物,反应12 h后,该酶(0.28 U)能分别从天然虾壳或蟹壳底物中释放(1.00±0.04)mg/mL或(1.71±0.11)mg/mL还原糖.本研究为功能性几丁寡糖、N-乙酰氨基葡萄糖制备和天然几丁质底物资源化利用提供参考.
基金项目
国家重点研发计划重点专项(2018YFD0501903)
国家自然科学基金(31902201)
浙江省生物工程一流学科开放基金(KF2020004)
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