摘要
食源微生物是影响食品质量与安全的重要因素,微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)能够对核酸进行绝对定量检测,在食源性致病菌检测中具有越来越重要的地位.为实现食源性致病菌基因组拷贝数的快速绝对定量检测,本研究从已报道的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)检测引物和探针中,经TaqMan探针法qPCR特异性验证,筛选获得以ttrA/ttrC、FMN-binding glutamate synthase、invasion associated endopeptidase基因为靶标的引物和探针,并将伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌检测探针连接6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein,FAM)基团、单核细胞增生李斯特氏菌检测探针连接六氯-6-甲基荧光素(hexachloro fluorescein,HEX)基团,分别构建3种目标菌株的单重ddPCR检测体系.在此基础上,通过引物和探针浓度和退火温度的优化构建可在同一反应体系中同时、快速、绝对定量检测伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌基因组拷贝数的多重ddPCR检测体系.多重ddPCR检测体系可扩增获得8(23)个微滴簇区域,对伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌定量检测的线性范围分别为235～0.23、284～0.18、380～0.42 copies/µL;在定量检测范围内的线性相关系数R2均大于0.999,且重复性较好,3种致病菌的多重ddPCR检测体系与单种菌的单重ddPCR定量线性范围几乎一致.本研究构建的多重ddPCR检测体系特异性强、稳定性好、定量范围广,可为食源性致病菌的无增菌绝对定量检测提供技术支持.
基金项目
广州市科技计划(201904010253)
广州市市场监督管理局科技项目(2020kj52)
国家市场监督管理总局科技计划(2019NK090)
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