摘要
前期通过高通量测序发现,受体互作丝氨酸苏氨酸激酶2(receptor interacting serine/threonine kinase 2,RIPK2)介导的NOD/RIPK2信号通路在鸡(Gallus gallus)免疫炎症反应过程中显著性富集.为研究RIPK2在鸡巨噬细胞系(chicken macrophage cell line,HD11)中免疫炎症的功能,本研究采用慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术,建立了稳定干扰RIPK2基因表达的HD11.根据鸡RIPK2基因的序列,设计了3个RNA干扰靶点序列和1个阴性对照序列,连接到pLVshRNA-EGFP(2A)Puro干扰载体,瞬时转染HD11.利用qRT-PCR技术检测各靶点对RIPK2的干扰效率,将干扰效率最佳的重组载体进行慢病毒包裹.利用包裹干扰载体的慢病毒感染HD11,采用qRT-PCR及Western blot检测不同实验组中RIPK2及NOD/RIPK2信号通路下游关键基因:核因子-κB激酶复合物抑制剂(component of inhibitor of nuclear factor kappa B kinase complex,IKKα)、因子-κB激酶亚单位β抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit beta,IKKβ)、核因子κB亚单位1(nuclear factor kappa B subunit 1,NFκB)和白细胞介素1β(interleukin 1 beta,IL1β)的表达量变化.同时构建了RIPK2过表达载体(pcDNA3.1-RIPK2),并以此载体开展RIPK2基因的拯救实验.构建了3条靶向RIPK2的慢病毒干扰表达载体RIPK2-shRNA1(小发卡RNA1,short hairpin RNA 1)、RIPK2-shRNA2和RIPK2-shRNA3,其中RIPK2-shRNA1和RIPK2-shRNA3重组质粒对RIPK2基因的干扰效率分别为(77.4±0.61)％和(90.21±0.68)％.将RIPK2-shRNA3重组质粒进行慢病毒包裹,获得病毒滴度为2×108 TU/mL;将RIPK2-shRNA3慢病毒转染HD11,干扰组RIPK2 mRNA和蛋白表达水平较对照组显著性降低(P<0.05),NOD/RIPK2信号通路下游关键基因IKKα、IKKβ、NFκB和IL1β的表达量发生了显著下调(P<0.05);干扰组转染RIPK2过表达载体(pcDNA3.1-RIPK2)后RIPK2的表达水平能够恢复.本研究成功构建了靶向鸡RIPK2的shRNA慢病毒表达载体,可有效沉默RIPK2基因在HD11中的表达,并且稳定表达RIPK2-shRNA3的HD11可干扰NOD/RIPK2信号转导,为进一步分析RIPK2参与的NOD/RIPK2信号通路的功能研究提供理论依据.
基金项目
国家自然科学基金青年基金(31802053)
江苏省自然科学青年基金(BK20180907)
中国博士后科学基金面上项目(2019M661950)
江苏省博士后面上基金(137070510)
扬州市省自然科学青年基金(YZ2017104)
扬州大学大学生科创基金(X20210658)
江苏省高等学校青蓝工程项目()
扬州市英才培育计划优秀教育人才项目(第四期)()
维普
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