摘要
肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因是肌肉发育的负调控因子,可调控细胞增殖.为探讨该基因突变在调控肌肉卫星细胞(muscle-derived satellite cells,MDSCs)增殖分化中的作用机制,本研究以分离培养的MSTN基因突变型和野生型蒙古牛(Bos taurus)MDSCs为研究对象,对其增殖及分化过程中的细胞周期和基因表达变化进行检测.EdU增殖实验结果显示,MSTN基因突变型肌肉卫星细胞增殖指数(0.78±0.06)显著高于野生型细胞(0.57±0.04),表明MSTN基因突变的细胞增殖加快.当加入诱导液向成肌分化诱导时,MSTN基因突变细胞在诱导1 d后出现分化的肌管,而野生型细胞在诱导2 d后开始分化;利用流式细胞术进一步分析成肌诱导对细胞周期的影响,发现MSTN突变型(MSTN mutant,MT)细胞在诱导1 d后细胞周期开始停滞在G1/S期,野生型(wild type,WT)细胞在诱导2 d后细胞周期出现停滞,这些结果表明,当细胞被诱导分化时,MSTN突变细胞先于野生型细胞退出细胞周期而进入分化状态.通过qPCR和Western blot对细胞周期相关基因和蛋白的表达进行检测,结果显示,在MSTN基因突变细胞中,CyclinA表达显著上调(19.5倍),而细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子1C(cyclin-dependent kinase inhibitor 1C,CDKN1C)的表达被显著抑制(0.9％),提示CyclinA和CDKN1C在MSTN基因突变调控肌肉卫星细胞增殖分化的过程中可能具有重要作用.通过JASPAR数据库进行在线预测,发现MSTN信号通路中关键转录因子SMAD2/SMAD3可能与CDKN1C基因的启动子结合;进一步的ChIP-qPCR实验结果显示,SMAD2/SMAD3可与CDKN1C启动子直接结合,并促进CDKN1C基因表达.上述结果提示,MSTN基因突变可能通过下调SMAD2/SMAD3转录因子与CDKN1C启动子的结合,从而抑制CDKN1C基因表达,进而上调CyclinA-CDK2表达,最终促进DNA合成和细胞周期进程.本研究为MSTN基因突变促进肌肉发育发掘了新的作用机制,为制备肌肉发达的基因编辑动物提供了参考依据.
基金项目
国家科技重大专项(2016ZX08007-002)
内蒙古自治区自然科学基金(2021BS08013)
维普
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