摘要
猪附红细胞体病是由猪支原体(Mycoplasma suis)、微小支原体(M.parvum)和浙江分离到的待定新种嗜血支原体(Candidatus M.haemosuis,CMh)引起猪(Sus Scorfa)传染性贫血、黄疸和母猪流产等症状的疾病.3种病原在我国猪群中的流行和传播情况不明,为鉴别诊断3种猪源嗜血支原体和了解该类病原在我国猪群中的流行特点,本研究建立了1种基于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)基因的三重TaqMan探针荧光定量PCR(qPCR)鉴别检测方法.根据已知的3种猪源嗜血支原体GAPDH基因序列,利用Beacon Designer 4.0软件分别设计特异性引物和探针.通过分别优化Mg2+浓度、热启动酶浓度、引物和探针浓度等反应条件,建立了三重TaqMan探针qPCR方法,并验证了该法的特异性、敏感性和重复性.结果表明,建立的三重TaqMan探针qPCR方法标准曲线相关系数R2在0.9992～0.9996之间,扩增效率在99.9％～103.2％之间;该法对其他常见猪病无扩增信号,具有良好的特异性;该法对3种猪源嗜血支原体的最低检测限均为1 copy/μL;组内和组间变异系数在0.31％～1.75％之间,表明重复性好.应用该法对浙江省148份猪抗凝血样品检测并与二重PCR符合比较,结果显示三重Taqman探针qPCR检测M.suis、M.parvum和CMh的阳性率分别为50％(74/148)、48.6％(72/148)和64.9％(96/148),3种病原的混合感染率为29.7％(44/148);二重PCR方法检测M.suis/M.parvum和CMh阳性率分别为29.1％(43/148)和15.5％(23/148),二重PCR阳性样品三重qPCR检测均阳性.本研究建立的方法可用于临床上M.suis、M.parvum和CMh的鉴别诊断,为猪源嗜血支原体病的流行病学调查和防控提供技术支撑.
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