摘要
对于山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)引起的羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor,ENT),目前已建立了RT-PCR结合限制性内切酶鉴定ENTV的方法以及RT-PCR和qPCR等检测方法,但是内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus,ERVs)的存在可干扰结果的准确性.本研究通过生物信息学方法将ENTV-2与ERVs和绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)进行比对,寻找ENTV-2囊膜蛋白(envelope protein,env)基因的保守序列并设计1对特异性引物,通过优化反应条件而建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve,HRM)检测方法.优化结果显示,最佳反应体系为:上下游引物各0.4μmol/L,模板1μL,styo9(2.5μmol/L)1μL,2×Premix Taq 10μL,补充ddH2O至终体积20μL;反应条件为:94℃2 min;94℃15 s,59℃15 s,72℃15 s,40个循环;之后进行熔解曲线分析.构建env基因重组阳性质粒作为标准品,对HRM方法的特异性、敏感性和重复性进行检测.结果显示,所建立的HRM方法的特异性强,与ENTV-2高度同源的ERVs无交叉反应;敏感性高,对env基因重组阳性质粒的最低检测限为82.7拷贝/μL;重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均<1％.对92份临床样品的阳性检出率为18.7％,与TaqMan检测方法的符合率为100％.本研究可为山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的早期、快速检测提供技术支持.
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