摘要
茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)能诱导灵芝(Ganoderma lingzhi)萜类的合成,为探究灵芝萜类生物合成与碱性/螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)基因及茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号调控之间的关系,本研究通过同源比对,从灵芝中克隆获得了与灵芝萜类合成相关的bHLH基因片段,进一步克隆了该基因的全长,并对其进行了生物信息学、转录活性、原核表达、亚细胞定位、过表达和沉默表达分析.结果显示,从灵芝中获得了一段与正调控丹参酮合成bHLH转录因子同源性较高的bHLH基因片段,qRT-PCR分析表明,该基因显著响应MeJA诱导,灵芝三萜(又称灵芝酸,ganoderic acid,GA)合成途径3个关键基因在MeJA诱导下表达量均显著增加(P<0.05),且表达模式与bHLH一致;克隆得到长度为1311 bp的GlbHLH1基因(GenBank No.MW981280.1),编码436个氨基酸,蛋白分子量为46.33 kD;启动子分析表明,灵芝三萜合成途径3个关键基因启动子区域均存在与bHLH转录因子相结合的G-box;系统进化分析显示,GlbHLH1与紫芝(G.sinense)的GsPIL37177.1亲缘关系最近;酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)体内的转录激活活性表明,该基因具有转录激活活性;成功构建了GlbHLH1基因的原核表达载体,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中表达出预期大小(约75 kD)的融合蛋白;亚细胞定位显示GlbHLH1主要定位于细胞核;转基因结果显示,与野生型相比,过表达与沉默菌株的GlbHLH1表达量分别显著上调或下调(P<0.05),且过表达菌株OE-GlbHLH1-1、OE-GlbHLH1-2和OE-GlbHLH1-3中三萜含量分别增加25％、22％和38％,沉默菌株Si-GlbHLH1-1和Si-GlbHLH1-2的三萜含量分别减少了约15％和30％.综上所述,GlbHLH1为控制灵芝三萜合成的转录因子.以上结果为进一步研究灵芝bHLH的分子调控机制提供理论依据.
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