摘要
鸡(Gallus gallus)原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)在转基因动物制备和种质资源保护领域具有广泛应用前景,为了解析鸡PGCs形成的分子机制,本研究前期鉴定了1个调节鸡PGCs形成的关键长链非编码RNA-骨形成蛋白(long noncoding RNA-bone morphogenetic protein 4,LncBMP4),可编码小肽EPC5(expression in primordial germ cells chromosome 5).本研究通过在线预测软件初步分析EPC5小肽的化学结构并进行初步的亚细胞定位.通过化学合成法构建PET-EPC5-His-B2M原核融合表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL2感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导后大量表达和纯化EPC5抗原.利用纯化的抗原进行动物免疫并收集抗血清(G1480,G1481),通过ELISA检测抗血清效价.纯化抗体并通过Western blot进行鉴定.结果表明,EPC5主要定位于细胞内并具有RNA聚合酶亚基.成功构建PET-EPC5-His-B2M载体,且诱导表达后重组蛋白大小约为25 kD.ELISA检测发现G1480抗血清效价为1:5.12×105(OD抗血清/OD免前血≥2.1),G1481抗血清效价为1:1.024×106(OD抗血清/OD免前血≥2.1).对G1480抗血清进行纯化,产生的EPC5多克隆抗体浓度为10 mg/mL,ELISA检测显示效价为9.8 ng/mL时(OD450>0.2).Western blot检测结果显示制备的多克隆抗体可以特异性结合体内外表达的EPC5蛋白.本研究成功地制备EPC5多克隆抗体,为进一步研究EPC5在PGCs形成过程中的功能和机制提供了基础.
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