摘要
牛病毒性腹泻病的感染情况日趋严重,给养殖业造成了严重的损失,目前我国缺乏有效的治疗手段,导致感染模式复杂化,其致病机制和病毒-宿主之间相互作用研究也尚不清楚.为了探究囊泡运输蛋白(vesicle transport protein homolog,SEC22B)敲低对牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)复制的影响,根据GenBank数据库中SEC22B基因序列,使用Benchling平台设计向导RNA(small guide RNA,sgRNA),克隆至LentiCRISPR v2载体后进行慢病毒包装,使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲低胎牛肾细胞(madin-darby bovine kidney cells,MDBK)中的SEC22B基因表达,使用Western blot鉴定SEC22B基因敲低(knockdown,KD)情况;BVDV感染SEC22B KD细胞不同时间后,分别使用qPCR和免疫荧光染色检测BVDV 5'UTR mRNA水平变化和双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)量,使用Reed-Muench法测定BVDV感染不同时间后子代病毒滴度变化.Western blot检测发现,与对照Scramble细胞相比,SEC22B KD细胞中SEC22B蛋白表达量显著降低;与BVDV感染Scramble细胞相比,BVDV感染SEC22B KD细胞后5'UTR mRNA水平和dsRNA量均极显著降低(P<0.01),同时,子代病毒滴度极显著下降(P<0.01).结果表明,敲低SEC22B基因后显著抑制BVDV复制,本研究为BVDV防控新方法的建立提供理论依据.
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