摘要
5'cDNA末端快速扩增(5'rapid amplification of cDNA ends,5'RACE)技术是基因转录表达调控研究的关键手段之一,其操作复杂,对样品要求较高.牛(Bos taurus)脂肪组织杂质含量高,单位体积RNA含量低,经常造成5'cDNA末端扩增的失败,影响脂肪沉积分子机制的研究.Kruppel样因子4(Kruppel-like factor 4,KLF4)是调控牛脂肪沉积的关键基因,为了准确鉴定牛KLF4基因在脂肪组织中表达的转录起始位点,揭示脂肪沉积关键基因的表达调控机理,以郏县红牛皮下脂肪组织为研究对象,对经典5'RACE技术进行改进.首先采用特异性反转录引物,仅反转录总RNA中的特定mRNA,以提高目标基因的反转效率,耐受更低浓度的RNA;然后,调整反转录体系,简化加尾前cDNA纯化步骤,减少目标cDNA的损失,保证后续RACE扩增中的模板浓度;最后,采用适当靠近mRNA 5'端的基因特异性引物(产生较短的RACE片段),降低RACE扩增中聚合酶延伸能力,模板二级结构等因素的干扰.通过上述改进措施,成功获得了KLF4基因的RACE片段.对该片段进行测序和比对分析后,发现郏县红牛KLF4基因的转录起始位点与NCBI数据库中以胞嘧啶C作为起始核苷酸的KLF4基因(NM_001105385)不同,其向5'端延伸了2个碱基(GA),以鸟嘌呤作为起始核苷酸,该结果更符合转录起始位点通常为一个嘌呤(A或G)的特征.分析不同长度RACE片段对PCR扩增的影响,结果发现较短的RACE片段(<500 bp)可以顺利扩增成功;而对于大于1000 bp的RACE片段,试剂盒法和优化法均没有获得有效片段.本研究通过优化5'RACE技术,成功鉴定了郏县红牛皮下脂肪KLF4基因的转录起始位点,该新位点证实了我国地方牛种的遗传特异性,为进一步研究该基因在脂肪沉积中的作用提供了参考.
基金项目
国家自然科学基金(31802043)
河南省自然科学基金(162300410227)
河南省高校重点研究项目(17A230007)
信阳师范学院青年科研基金(2018-QN-044)
国家级大学生科创项目(S201810477010)
信阳师范学院生科院特色骨干学科培育项目()
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