摘要
挖掘和利用高直链淀粉基因颗粒结合型淀粉合成酶(waxy,Wx)的等位变异Wxa是当前水稻(Oryza sativa)育种的热点之一,而便捷地筛选基因Wxa是关键.本研究设计水稻高直链淀粉基因Wxa的可视化环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)功能标记,探索便捷的筛选方法.首先通过序列比对,找出Wxa基因的Ex10-115(T/C)变异位点及上下游一致性序列作为目标序列.然后用Primer3 Input、NEBcutter V2.0和PrimerExplore V5等软件,在目标序列上设计用于基因型鉴定的酶切扩增多态性标记(cleaved amplified polymorphic sequences,CAPs)和LAMP标记,最后对标记的可视化检测进行测试.结果显示,在Ex10-115(T/C)变异位点附近有保守序列,据此设计出了CAPs标记(Wxa-2F和Wxa-2R)和LAMP标记(F3,B3,FIP和BIP).用CAPs标记对10个水稻品种进行检测,结果显示,'D62B'、'G46B'、'Ⅱ-32B'、'ZS97B'和'GLA4'等品种携带Wxa基因,直链淀粉含量也较高,而其他5个品种不携带Wxa基因,基因型与表型一致.用LAMP标记结合显色剂羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB),63℃恒温反应60 min,裸眼可观察水稻品种是否携带Wxa基因,与CAPs标记的检测结果一致.本研究设计了筛选水稻Wxa基因的便捷方法,研究结果可为水稻其他重要基因的功能标记开发及应用提供参考.
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