摘要
miRNA(microRNA,miR)是可参与基因转录后调控的内源性非编码小RNA,miR-10b是猪(Sus scrofa)卵巢闭锁过程中的一个关键调控因子,而其靶向基因同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)基因在细胞凋亡中起着重要作用.为探讨miR-10b和PTEN基因对猪卵巢颗粒细胞(pig ovarian granulosa cells,pGCs)凋亡的调控作用,本研究分别用miR-10b的模拟物及抑制物转染pGCs,构建过表达和抑制miR-10b的pGCs模型,采用流式细胞术检测过表达和抑制miR-10b对pGCs凋亡的影响.结果显示,过表达miR-10b极显著增加了pGCs凋亡率(P＜0.01),抑制miR-10b表达后pGCs凋亡率极显著降低(P＜0.01).基于生物信息学分析可知,miR-10b能直接结合PTEN3'UTR区.进一步构建通过荧光素酶报告基因载体,发现相对于pmirGLO-PTEN-WT与mimic NC共转染组,pmirGLO-PTEN-WT与miR-10b mimic共转染后的荧光活性更低(P＜0.01),pmirGLO-PTEN-MUT与miR-10b mimic共转染,或与mimic NC共转染后,荧光活性无显著差异(P＞0.05),pmiGLO与miR-10b mimic共转染,或与mimic NC共转染的荧光也无显著差异(P＞0.05),通过双荧光素酶报告基因系统再次证实了miR-10b能靶向结合PTEN3'UTR区,抑制PTEN基因表达.利用qPCR及Westren blot检测PTEN基因及其蛋白的表达水平,发现miR-10b可以抑制PTEN基因及其蛋白的表达水平.此外,在抑制miR-10b表达后,引入siRNA下调PTEN基因的表达,可以缓解miR-10b对pGCs凋亡的促进作用.本研究证实了miR-10b可以通过抑制靶基因PTEN的表达来调控pGCs凋亡,为深入了解pGCs的凋亡机制和研究卵泡发育提供了数据支持.
基金项目
国家重点研发计划(2021YFD1301200)
国家自然科学基金(31972531)
安徽省高校协同创新项目(GXXT-2021-055)
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