miR-2779-x对MDCK细胞生长特性的影响及靶基因筛选验证
Effect of MiR-2779-x on the Growth Characteristics of MDCK Cells and Verification of Target Gene Screening
黄玲巍 1杨迪 2靳莉武 1杨雅雯 3王家敏 4乔自林 4阿依木古丽·阿不都热依木1
作者信息
- 1. 西北民族大学生物医学研究中心/细胞基质疫苗关键技术与产业化教育部工程研究中心,兰州 730030;西北民族大学生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心,兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,兰州 730030
- 2. 西北民族大学生物医学研究中心/细胞基质疫苗关键技术与产业化教育部工程研究中心,兰州 730030;西北民族大学实验教学部,兰州 730030
- 3. 西北民族大学生物医学研究中心/细胞基质疫苗关键技术与产业化教育部工程研究中心,兰州 730030;西北民族大学生命科学与工程学院,兰州 730030;西北民族大学生物医学研究中心/生物工程与技术国家民委重点实验室,兰州 730030
- 4. 西北民族大学生物医学研究中心/细胞基质疫苗关键技术与产业化教育部工程研究中心,兰州 730030;西北民族大学生物医学研究中心/甘肃省动物细胞技术创新中心,兰州 730030;西北民族大学生物医学研究中心/生物工程与技术国家民委重点实验室,兰州 730030
- 折叠
摘要
犬肾细胞系MDCK(Madin Darby Canine Kidney)是生产流感病毒疫苗最常用的细胞系之一,miR-2779-x作为非编码RNA能够抑制MDCK细胞的自发肿瘤转化.本研究基于慢病毒系统构建过表达及敲低miR-2779-x的稳转细胞株,利用细胞增殖检测试剂盒CCK-8(Cell Counting Kit-8)、细胞凋亡和细胞周期检测试剂盒以及细胞划痕试验、软琼脂克隆试验对稳转细胞株进行检测.结果显示,miR-2779-x过表达使细胞增殖能力和相对迁移率显著降低(P＜0.01)、侵袭能力增加(P＜0.01),敲低细胞株的结果与之相反;过表达细胞株的早期凋亡率显著提高(P＜0.01),敲低细胞株的晚期凋亡率显著提高(P＜0.01);miR-2779-x过表达使细胞在S期发生阻滞,敲低细胞株在G0/G1期发生阻滞.半数组织培养感染剂量(50%tissue culture infective dose,TCID50)检测结果显示,转入过表达及敲低miR-2779-x慢病毒的MDCK细胞对甲型H1N1流感病毒株的敏感性无显著变化.通过qRT-PCR和Western blot验证miR-2779-x靶基因的表达变化,发现多个与转化致瘤和生长相关的基因受到miR-2779-x负调控,推测靶基因CASP9(caspase 9)可能作为凋亡通路因子与PI3K/AKT信号通路共同调控MDCK细胞增殖.本研究为建立新型MDCK细胞系提供了新思路,可为流感疫苗生产提供更好的细胞基质.
Abstract
Madin Darby Canine Kidney(MDCK)cell line is one of the most commonly used cell lines to produce Influenza virus vaccine,and miR-2779-x,as a non-coding RNA,can inhibit spontaneous tumor transformation in MDCK cells.In this study,stable cell lines with overexpression and knockdown of miR-2779-x were constructed based on the lentivirus system,and the transfected cells were detected by cell proliferation detection kit CCK-8(Cell Counting Kit-8),cell apoptosis and cell cycle detection kit,as well as cell scratch test and soft agar cloning test.The results showed that overexpression of miR-2779-x significantly decreased cell proliferation and relative mobility(P＜0.01),and increased cell invasion(P＜0.01),while knockdown cell lines showed opposite results.The early apoptosis rate of overexpressed cell lines and the late apoptosis rate of knockdown cell lines were significantly increased(P＜0.01).miR-2779-x overexpression caused cell block in S phase,and knockdown cell lines were blocked in G0/G1 phase.Measured at 50%tissue culture infective dose(TCID50),the sensitivity of MDCK cells with miR-2779-x lentivirus overexpression and knockdown did not change significantly to Influenza virus A H1N1.The expression changes of miR-2779-x target genes were verified through qRT-PCR and Western blot,and multiple genes related to transformation,tumorigenesis,and growth were found to be negatively regulated by miR-2779-x.It is speculated that the target gene CASP9(caspase 9)might act as an apoptotic pathway factor and co-regulate MDCK cell proliferation with PI3K/AKT signaling pathway.This study provides a new approach for establishing a novel MDCK cell line,which can provide a better cell matrix for influenza vaccine production.
关键词
MDCK细胞/miR-2779-x/生长特性/靶基因Key words
MDCK cells/miR-2779-x/Growth characteristics/Target gene引用本文复制引用
基金项目
甘肃省教育厅高校教师创新基金(2023B-058)
中央高校基本科研业务费资金专项(31920230001)
出版年
2024
国家科技期刊平台
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