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谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统的优化

Optimization of CRISPR/Cas9-based multiplex base editing in Corynebacterium glutamicum

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作为新型的基因组编辑工具,碱基编辑技术结合了CRISPR/Cas系统的定位功能和碱基脱氨酶的编辑功能,可实现特定位点的碱基突变,具有不产生双链DNA断裂,无需外源模板且不依赖染色体DNA同源重组的优势.目前,研究者们已在重要的工业生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中开发了多种碱基编辑工具,并实现了两基因和三基因的同时编辑.文中针对谷氨酸棒杆菌中基于CRISPR/Cas9的多位点碱基编辑系统中存在的不足(多重sgRNA结构烦琐、重复序列干扰、更换靶点困难等),采用多种策略进行优化,并比较碱基编辑效率:首先优化基于单独启动子/终止子的多重sgRNA表达框,通过构建框架质粒,并结合Golden Gate连接方法,加速靶点更换,避免重复序列干扰,虽然该方法sgRNA结构烦琐,但编辑效率最高;同时,开发基于Type Ⅱ CRISPR crRNA阵列、tRNA加工的多重gRNA表达框,这两种形式均只需要一个启动子和一个终止子序列,极大地简化了表达框结构,虽然编辑效率均出现下降,但仍具有一定的实用性.该研究丰富了谷氨酸棒杆菌的基因组编辑工具,为该菌株的遗传改造提供了更多的技术支持.

卢挥、张启、于思礼、王钰、康明、韩双艳、刘叶、王猛

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华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006

中国科学院天津工业生物技术研究所,天津300308

河北大学生命科学学院,河北保定071002

中国科学院大学生命科学学院,北京100049

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碱基编辑 谷氨酸棒杆菌 CRISPR/Cas系统 多重gRNA

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2018YFA090290031970063QYZDB-SSW-SMC012153D31KYSB20170121TSBICIP-PTJS-003

2022

10.13345/j.cjb.210109

生物工程学报
中国科学院微生物研究所 中国微生物学会

生物工程学报

CSTPCDCSCD北大核心
影响因子：0.641
ISSN：1000-3061
年,卷(期)：2022.38(2)
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