摘要
为摆脱限制性酶切位点不足的限制,构建可灵活改变多基因融合方向的表达载体,基于ⅡS型和ⅡT型限制性内切酶LguⅠ和BbvC Ⅰ设计开发了 LB克隆系统.该克隆系统是以广宿主质粒pBBR1MCS-3为初始载体,利用 PCR的方法,在其多克隆位点区插入LB片段(GCTCTTCCTCAGC)构建得到的.LB片段含Lgu Ⅰ和BbvC Ⅰ部分重叠识别位点,经这两种限制性内切酶酶切后可以产生相同非回文序列,利用这一性质可快速、灵活地将多个基因逐步、定向插入表达载体.为验证该克隆系统的有效性,将鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)WG中两个糖基转移酶基因welB、welK逐步定向融合至LB克隆载体,并将重组质粒转入鞘氨醇单胞菌中表达.结果表明,基因融合表达对鞘氨醇胶产量影响较小,但是,对鞘氨醇胶粘度有重要影响.在发酵84 h时,重组菌株Sphingomonas sp.WG/pBBR1MCS-3-LB-welKB的发酵液粘度较野生株提高约24.7％,粘度提升将有助于该鞘氨醇胶在石油开采、食品等多个领域的应用.综上所述,以鞘氨醇单胞菌为研究对象,验证了 LB克隆系统在多基因融合中的应用,为构建融合酶提供了一种高效的方法.
基金项目
国家自然科学基金(31800075)
国家自然科学基金(U1805234)
国家高技术研究发展计划(863计划)(2015AA020925)
中央高校基本科研业务费专项资金及重质油国家重点实验室开发基金(20CX02202A)
工业生物催化福建省高校工程研究中心开放基金(ERCIB2020-01)
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