摘要
本研究旨在利用水稻胚乳生物反应器表达新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)HN蛋白,建立一种NDV抗体半定量、快速免疫层析检测方法.通过Mly Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切重组质粒pUC57-HN,Nae Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切包含有启动子、信号肽和终止子的pMP3中间载体,分别回收HN和pMP3片段并进行连接,构成重组质粒pMP3-HN1.然后利用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切pMP3-HN1和植物载体pCAMBIA1300,将HN1基因成功连接到pCAMBIA1300上,采用电转化方法将重组质粒pCAMBIA1300-HN1导入根癌农杆菌EHA105.通过农杆菌介导法将pCAMBIA1300-HN1转入水稻愈伤组织.经过暗培养、愈伤筛选、分化、生根和移栽,4个月后获得转基因水稻种子.经PCR鉴定,HN基因已插入到水稻基因组中.SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果表明,水稻胚乳成功表达了HN蛋白,且该蛋白通过SP阳离子层析和凝胶过滤层析,其纯度达到90％以上.根据国家制定的新城疫血凝抑制(hemagglutination inhibition,HI)试验诊断技术标准(HI≥4log2,检测的抗体为阳性),利用胶体金标记HN蛋白,通过双抗夹心法制备NDV抗体半定量快速检测试纸.结果显示:试纸与其他病毒的阳性血清无交叉反应,且试纸对新城疫标准阳性血清的敏感性可达到1 ∶102 400.根据308份临床血清的检测结果,NDV抗体试纸与和HI试验的符合率为97.08％,Kappa值为0.942.综上所述,获得了高纯度水稻胚乳表达的重组HN蛋白,并研制了一种简单、快速、灵敏度高、特异性强的半定量免疫层析试纸.该试纸能够初步应用于新城疫疫苗的免疫评价.
基金项目
转基因生物新品种培育重大专项(2016ZX08001006-10)
河南农业大学校级项目(30601543)
NETL
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