摘要
血浆外泌体微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)与癌症的发生、诊断和治疗密切相关,但其分子机制尚不明晰.本研究探讨了癌症病人血浆外泌体miRNAs在cDNA文库构建中非特异性扩增的解决方案.在酶切法中,采用核酸外切酶T(exonucleaseT,EXOT)和phi29 DNA聚合酶降解引物;在磁珠法中,利用DNA结合磁珠分离模板和引物.随后,采取琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测磁珠分离情况,运用 RT-qPCR检测癌症病人血浆外泌体miRNA和不同连接物的含量变化.结果显示,非特异性扩增来源于miRNA的连接物USR5SR;核酸外切酶T(EXOT)和phi29DNA聚合酶虽可降解USR5SR,但模板链也会发生降解;磁珠分离法中以9％PEG沉淀引物片段、15％PEG沉淀模板链效果最佳.综上所述,磁珠分离法能够高效解决cDNA文库构建中的非特异性扩增,从而实现293T细胞和癌症病人血浆外泌体miRNA cDNA文库的成功构建.
基金项目
国家十三五科技重大专项(2019ZX09721001-007-002)
深圳科学技术项目(JCYJ20180507183842516)
国家重点研发计划(218YFA0903000)
国家自然科学基金(82174531)
国家自然科学基金(21606013)
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