摘要
基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂.利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定.基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid,MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno,Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选.利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg.通过一系列优化实验,使用0.4 μmol/LMpro与5 μmol/L底物建立了 Z'因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素.通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用.本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础.
基金项目
国家自然科学基金(81370087)
国家自然科学基金(81703546)
安徽省自然科学基金(1808085QH265)
安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2019ZD30)
安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2021A0839)
安徽省高等学校自然科学研究项目(YJS20210549)
皖南医学院大学生科研金项目(WK2021XS54)
皖南医学院青年骨干人才项目(wyqnyx202104)
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