摘要
聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK)在体外催化合成ATP的反应中有着重要作用.为寻找能利用短链聚磷酸盐(polyphosphate,polyP)为底物高效合成ATP的聚磷酸激酶,本文以来源于泗阳鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)的聚磷酸激酶(PPK2)为研究目标,利用pET-29a构建重组质粒,在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中表达,并将其作为ATP再生系统的关键酶与L-氨基酸连接酶(YwfE)联用生产丙谷二肽(Ala-Gln).ppk2长度为810 bp,编码270个氨基酸;SDS-PAGE结果表明PPK2为可溶性表达,分子量为29.7 kDa.对PPK2的最适反应条件进行了优化,结果发现其在22-42℃、pH 7-10的范围内均可以保持较好活性,且在37℃、pH为7、镁离子(Mg2+)浓度为30 mmol/L、底物ADP与六偏磷酸钠浓度分别为5 mmol/L和10mmol/L时酶活最大,在0.5 h时ATP产率可以达到理论值的60％以上.作为模式反应体系,当PPK2与YwfE联用生产Ala-Gln时,达到与直接添加ATP相同的效果.此聚磷酸激酶作为ATP再生系统具有较好的适用性,适用的温度和pH范围广,且能以廉价易得的短链polyP为底物高效合成ATP,为依赖ATP的催化反应体系的能量再生提供了新酶的来源.
基金项目
中央高校基本科研业务费专项(DUT21YG130)
中国博士后科学基金(2021M690518)
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