摘要
副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是世界范围内引起海产品相关食物中毒的主要致病菌,具有很强的生物膜形成能力.ToxR是一种膜结合调控蛋白,对副溶血弧菌生物膜形成具有一定的调控作用,但具体机制尚未见报道.c-di-GMP是一种普遍存在于细菌中重要的第二信使,参与调控细菌的多种生物学行为包括生物膜的形成.本文探究ToxR对副溶血弧菌中c-di-GMP代谢的调控作用.利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定副溶血弧菌野生株(wild-type,WT)和toxR突变株(△toxR)中c-di-GMP水平的差异.挑选c-di-GMP代谢相关基因scrA、scrG和vpa0198为进一步研究的靶标,采用实时定量qPCR实验检测靶基因在WT和△toxR中的转录水平差异;将靶基因调控区DNA序列克隆入pHRP309质粒中无启动子的β半乳糖苷酶基因上游,采用lacZ报告基因融合实验进一步研究ToxR对靶基因的转录调控关系;将重组质粒分别导入含有pBAD33或pBAD33-toxR的EC100λpir中,采用lacZ报告基因融合实验研究ToxR是否能在异体宿主中调控靶基因的表达;PCR扩增靶基因上游调控区DNA序列,并纯化 His-ToxR 蛋白,用凝胶阻滞实验(electrophoresis mobility shift assay,EMSA)研究 His-ToxR 与靶基因启动子区DNA序列是否具有结合作用.ELISA结果显示△toxR中c-di-GMP含量显著性高于WT中的,说明ToxR抑制c-di-GMP的产生;实时定量qPCR结果表明WT中scrA、scrG和vpa0198的转录水平显著性高于△toxR中的,表明ToxR抑制它们的转录;lacZ报告基因融合实验结果表明ToxR可抑制副溶血弧菌和EC100λpir中scrA、scrG和vpa0198的启动子区活性;EMSA实验显示His-ToxR能特异性地结合到scrA和scrG的上游调控区DNA序列上，而对vpa0198的上游调控区DNA序列无结合作用.综上所述，ToxR 通过直接调控相关酶蛋白基因的转录来抑制副溶血弧菌内c-di-GMP的合成，从而有助于精确调控生物膜形成等细菌行为.
基金项目
国家自然科学基金(82072239)
中央高校基本科研业务费专项(JUSRP121061)
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