摘要
目的:采用CRISPR/Cas9系统建立胰岛素样生长因子受体2(IGF-ⅡR)基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-ⅡR对人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性的影响机制提供细胞模型.方法:根据AAVS1基因序列设计并合成6对小向导RNA(sgRNA),用UCA CRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与pCS载体连接,筛选效率最高的sgRNA构建Cas9/sgRNA表达载体;用AsiSⅠ+Bstz17Ⅰ酶切将IGF-ⅡR片段连入hAAVS1-KI载体,构建IGF-ⅡR打靶载体,EcoRⅠ+ScaⅠ、NcoⅠ、BglⅡ酶切鉴定并测序验证;将Cas9/sgRNA载体和IGF-ⅡR打靶载体电转SKBR3细胞,经嘌呤霉素筛选,PCR鉴定,获得IGF-ⅡR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体及有限稀释方式制备单克隆.结果:构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2具有最高效率;构建了作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sgRNA载体,sgRNA活性检测显示sgRNA2较sgRNA1、sgRNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-ⅡR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200 V、20 ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/mL;IGF-ⅡR打靶载体及pCS-sgRNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确.结论:获得IGF-ⅡR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-ⅡR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定了基础.
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