摘要
目的:探索体外诱导小鼠胚胎干细胞(mESC)产生具有T淋巴谱系潜能造血祖细胞的关键步骤和操作技巧,进一步明晰及优化诱导策略,提高功能性血液细胞的体外再生效率.方法:将Runx1和Hoxa9串联重组质粒转染mESC产生iR9-mESC,体外依次诱导可先后产生拟胚体(EB)、诱导性生血内皮细胞(iHEC)、诱导性造血祖细胞(iHPC),随后移植免疫缺陷鼠可检测到受体小鼠中枢和周围淋巴器官中供体来源的T淋巴细胞.其中,在体外培养mESC,电转获得同源重组iR9-mESC,诱导分化形成EB、iHEC及其分选、流式检测和移植等步骤设置不同操作方法对照组.结果:体外培养iR9-mESC时,培养在小鼠胚胎成纤维细胞上比在明胶上更能维持mESC的多能性状态;电转时细胞量为1.2×106能保证电转后培养过程中单个克隆不融合,便于筛选鉴定目的克隆;用巴氏吸管轻柔吹打收集EB保证球状EB的完整性,可以提高诱导分化过程中形成iHEC的比例;分选前免疫磁珠富集CD31+细胞,能提高目的细胞纯度,缩短分选时间,增加细胞活性;尾静脉移植可增加移植成功率和移植细胞数目的准确性.结论:mESC体外诱导分化产生T谱系潜能的造血祖细胞过程中,细胞培养浓度、操作方法细节、工具的使用、分选和移植方法的选择都会影响诱导过程中iHEC和造血祖细胞的含量和谱系特异性,需要针对各分化步骤和时间节点精准操作.
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