摘要
目的:比较不同的DNA提取方法、实时荧光定量PCR(qPCR)的引物及荧光染料对人卵泡液游离核DNA(cf-nDNA)和游离线粒体DNA(cf-mtDNA)定量检测的影响.方法:收集2018年3月～10月在华中科技大学同济医学院生殖医学中心进行体外受精/卵胞浆内单精子显微注射技术(IVF/ICSI)的40例患者卵泡液样本,分别用4种不同的方法(方法一:BeaverBeadsTM Circulating DNA试剂盒、方法二:蛋白酶K(PK)法、方法三:Hieff® qPCR SYBR® Green Master Mix和方法四:KOD SYBR® qPCR Mix)提取和纯化卵泡液中的游离DNA(cf-DNA)样本;用4种cf-nDNA引物(ALU115、B2MF1、GAPDH 和β-globin)和 4 种 cf-mtDNA 引物(ND1-primer1、ND1-primer2、hmito3 和hmito5)分别定量检测卵泡液cf-nDNA和cf-mtDNA水平;比较qPCR实验中SYBR Green化学染料和TaqMan探针两种方法在定量检测上的差异.结果:提取cf-nDNA的浓度按以下顺序排列:方法一＞方法四＞方法二＞方法三(P＜0.05),提取cf-mtDNA的浓度按以下顺序排列:方法一＞方法四＞方法三＞方法二(P＜0.05);样本中cf-nDNA的扩增浓度按照以下顺序排列:ALU115＞GAPDH＞β-globin＞B2MF1(P＜0.05),4 种 cf-nDNA 引物无相关性(P＞0.05).cf-mtDNA 的扩增浓度按以下顺序排列:ND1-primer1＞ND1-primer2＞hmito5＞hmito3(P＜0.05).ND1-primer1 和 ND1-primer2 有很强的相关性(r=0.517,P＜0.05),hmito3和hmito5也有很强的相关性(r=0.989,P＜0.05);在以β-globin和ND1-primer1为引物的qPCR实验中,TaqMan探针法检测的Ct值高于SYBR Green化学染料法(P＜0.05).结论:人卵泡液样本的提取方法、引物和荧光染料的选择均影响cf-nDNA和cf-mtDNA的定量,建议根据不同的研究目的选择合适的方法.
基金项目
湖北省卫生健康委员会面上项目(WJ2019M112)
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