摘要
该研究利用Gateway技术构建珠子参环阿屯醇合成酶基因(Panax japonicus cycloartenol synthase,Pj-CAS)的RNAi表达载体,利用农杆菌介导转化在珠子参细胞中成功实现了PjCAS的RNA干扰;采用实时荧光定量PCR分析珠子参皂苷生物合成途径中关键酶基因的表达情况,同时检测转基因细胞中皂苷和植物甾醇含量的变化,探讨PjCAS基因对珠子参皂苷合成的调控作用.结果表明:(1)成功获得PjCAS基因的RNAi片段,并成功构建了PjCAS基因RNAi载体pHellsgate-PjCAS.(2)经农杆菌遗传转化,获得6株实现PjCAS基因RNA干扰的转基因阳性细胞系.(3)与普通细胞系相比,转基因细胞系中PjCAS基因的表达量大约下降了85％,同时与珠子参皂苷合成直接相关的关键酶基因PjDS、PjAS表达量最高分别上调了90％和150％.(4)转基因细胞系中6种单体皂苷的含量均显著高于对照组,其中达玛烷型单体皂苷Re、Rb1、Rd和齐墩果烷型单体皂苷R0、IV、IVa的平均含量比普通珠子参细胞系分别提高了28％、49％、40％、36％、59％、50％.说明珠子参皂苷含量的变化受PjCAS基因的间接调控.(5)6株转基因细胞系中植物甾醇含量较对照显著降低了53％～73％.研究发现,沉默PjCAS基因可促进珠子参皂苷合成的关键酶基因PjDS、PjAS显著上调表达,并提高转PjCAS基因细胞系中单体皂苷的含量,从而促进了珠子参皂苷合成量的显著增加,证明通过抑制植物甾醇合成通路关键基因PjCAS的表达可以有效降低植物甾醇合成支路的代谢通量,使更多的代谢流朝着珠子参皂苷合成方向流动,最终促进了珠子参皂苷的生物合成.
基金项目
国家自然科学基金(31260070)
云南省重大科技计划(2019ZF011-2)
云南省万人计划(YNWR-QNBJ-2018-059)
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