为创制棉花耐旱种质资源,解决棉花耐旱资源贫乏以及提高水资源利用率,研究依据CRISPR/Cas9编辑原理,对课题组前期利用RT-PCR技术筛选耐旱相关基因GhNAC3(Gh_D02G0790)的第一外显子区域设计2个20 bp的编辑靶点,并在陆地棉基因组数据库中比对分析靶点序列,排除非特异性编辑,将2个靶点核苷酸片段分别与gRNA-AtU6载体连接,通过2次PCR扩增,得到含特异性连接接头的AtU6-GhNAC3表达盒,再将表达盒连接到CRISPR/Cas9(pRGEB32-7)载体上,获得CRISPR-GhNAC3重组表达载体,利用农杆菌介导法转化陆地棉受体YZ-1,再生培养得到T0代转基因幼苗,通过PCR检测Cas9蛋白基因获得阳性株系.对T0代植株的靶点区域序列进行PCR扩增和测序分析,鉴定GhNAC3编辑类型.结果发现,CRISPR9-GhNAC3表达载体成功转化YZ-1,并获得40株转基因再生植株,经Cas9蛋白基因鉴定得到30株阳性株系,从阳性植株选择10株进行编辑类型测序分析,发现7株在靶点区域发生编辑,编辑类型主要为碱基片段缺失,缺失片段大小为3～28 bp,T1代种植于大田,获得了同时出现黄化和矮化的突变体3株.
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