摘要
目的 探究小鼠前脂肪细胞分化过程中STAU1对Foxp1 mRNA转录后的调控作用.方法 培养3T3-L1前脂肪细胞,采用鸡尾酒法诱导其分化为成熟脂肪细胞,分别收取第0天和第4天样本进行RNA测序筛选出差异倍数(FC)>2的转录因子;提取第0、1、2、3、4天细胞总RNA进行实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验验证.RBPDB数据库预测Foxp1的RNA结合蛋白.转染空载体质粒和STAU1过表达质粒后将细胞分为对照组和STAU1过表达组,提取第0、12、24、36、48小时细胞总RNA.利用RT-qPCR及Western-Blot实验检测两组3T3-L1细胞STAU1过表达效率、分化过程中Foxp1的mRNA和蛋白质表达水平.10只雄性2～3周龄C57BL/6小鼠的腹股沟白色脂肪组织(inguinal white adipose tissue,iWAT)分离培养的血管基质部分(Stromal vascular fraction,SVF)细胞,鸡尾酒法诱导分化,感染慢病毒,利用免疫荧光实验检测SVF细胞中Foxp 1的蛋白质表达水平,用catRAPID软件进行预测.RNA免疫共沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)实验检测STAU1与Foxp1 mRNA 3'非翻译区(3'un-translated region,3'UTR)STAU1结合位点(Staufen binding site,SBS)的结合情况.转染质粒24 h后加入放线菌素D,提取第0、1、2、4、6、8小时细胞总RNA,利用RT-qPCR实验检测两组3T3-L1细胞STAU1对Foxp1 mRNA稳定性的影响.结果 经RNA-seq筛选出5个表达上调和5个表达下调的转录因子;RT-qPCR验证结果显示,在成脂过程中Foxp1 mRNA的表达逐渐下降,PparγmRNA的表达逐渐上调;RBPDB数据库结果显示,STAU1是Foxp1的RNA结合蛋白;与对照组比较,STAU1过表达组STAU1的mRNA和蛋白质表达水平显著升高(P<0.05),Foxp1的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低(P<0.05);免疫荧光结果显示,与对照组比较,STAU1过表达组中Foxp1相对荧光强度降低(P<0.05);RNA免疫沉淀实验后的PCR验证结果显示,STAU1与Foxp1 mRNA 3'UTR的6714～7000 bp存在结合;与对照组比较,STAU1过表达组Foxp1的mRNA稳定性显著下降(P<0.05).结论 STAU1通过结合在Foxp1 mRNA 3'UTR上,启动STAU1介导的mRNA降解途径(Staufen-mediated decay,SMD)降解其mRNA,下调Foxp 1的mRNA表达水平.
基金项目
国家自然科学基金(81873664)
国家自然科学基金(82260177)
新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJ2022G184)
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