摘要
背景与目的:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)仍是当今中国乃至全世界的高发肿瘤之一,大部分HCC患者确诊时处于中晚期,对化疗耐药或介入治疗抵抗是影响此类患者生存预后的重要因素,但其中涉及的具体分子机制尚未完全明确.我们的前期研究发现长链非编码RNA LINC00601在奥沙利铂耐药的HCC细胞中高表达.本研究旨在探索LINC00601调控HCC细胞对奥沙利铂化疗耐药的作用及其机制,为临床筛选适宜接受奥沙利铂化疗的HCC患者并为中晚期HCC患者的治疗提供新的靶点和理论依据.方法:利用体外长期低剂量奥沙利铂刺激人HCC细胞株MHCC-97H和Hep-3B,建立奥沙利铂耐药细胞株97H-OXR和3B-OXR.采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)检测奥沙利铂耐药细胞株中LINC00601的表达情况.进一步采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)实验检测LINC00601基因沉默或过表达对HCC细胞奥沙利铂化疗耐药的影响.通过流式细胞术和蛋白质印迹法(Western blot)检测细胞凋亡情况的变化.最后采用Western blot和免疫荧光染色检测生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45α(growth arrest and DNA damage-inducible protein 45α,GADD45A)的核转位,并通过RNA pull-down实验和RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)实验验证LINC00601和GADD45A的结合.结果:与对照组细胞相比,奥沙利铂耐药细胞株中LINC00601的表达水平显著升高.奥沙利铂耐药细胞及过表达LINC00601的MHCC-97H细胞对奥沙利铂体外刺激的敏感性显著下降;相反,下调耐药细胞中LINC00601的表达后,其对于奥沙利铂体外刺激的敏感性明显提高.同时,在奥沙利铂的处理下,高表达LINC00601的HCC细胞株的凋亡水平被明显抑制,且与不同细胞株对奥沙利铂体外处理的敏感性水平相一致.此外,LINC00601的过表达使GADD45A的核转位水平降低,细胞核中GADD45A的表达下降.进一步研究发现LINC00601与GADD45A可以相互结合.结论:LINC00601可能通过调控GADD45A的核转位,进而抑制奥沙利铂处理后的细胞凋亡,导致HCC奥沙利铂耐药.
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