摘要
本文旨在研究猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA在猪睾丸支持细胞(ST)中的干扰作用.利用PCR法从ST细胞基因组中扩增猪睾丸ACE启动子,构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,通过红色荧光蛋白表达和双荧光素酶报告基因检测试验检测猪睾丸ACE启动子在ST细胞中的转录活性;根据SPAG6 mRNA靶序列设计合成 3 条siRNA序列,通过脂质体转染至ST细胞,利用实时荧光定量PCR及Western Blot检测siRNA的干扰效率;基于人miR-30a结构设计SPAG6 shRNA,构建重组载体ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,Western Blot检测其对SPAG6 的干扰效果.结果表明,成功构建重组质粒ACE-pIRES2-DsRed、ACE-pGL3-basic,并证明猪睾丸ACE启动子在ST细胞中具有较强的转录活性;各试验组均能对靶基因SPAG6 mRNA的表达产生抑制作用,以siRNA-3 的作用最佳.siRNA-3 转染 48 h后,SPAG6蛋白表达量显著下降(P<0.001),成功筛选出SPAG6基因的最佳干扰序列;成功构建重组质粒ACE-sh-SPAG6-pcDNA3.1,转染ST细胞 48 h后SPAG6 蛋白表达量较阴性对照组显著下调(P<0.001).本研究成功构建了猪睾丸ACE启动子驱动的SPAG6 shRNA真核表达载体,并在ST细胞中验证了其具有较好的干扰效果.
基金项目
农业关键核心技术攻关项目(NK2022010207)
湖南省重点领域研发计划(2020WK2030)
中国科学院战略性先导科技专项(XDA24030204)
湖北省农业科技创新中心项目(2022-620-000-001-20)
湖北省农业科学院领军人才项目(L2018015)
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