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比较CRISPR/Cas9和PE技术对HEK293T细胞中eGFP基因的编辑效率影响

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为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因CRISPR/Cas9 和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体,确定CRISPR/Cas9 和PE对eGFP基因的编辑效率,本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析,人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA,构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒;培养 293T细胞,利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和Hi-TOM深度测序,检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型,同时预测不同编辑类型蛋白结构变化.结果发现,eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组;eGFP-PE2 组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2 和PE3b的编辑效率分别为 20.420%、36.735%和 40.180%;PE3b较PE2 编辑效率提升 3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到 83 个(34.73%),eGFP-CRISPR/Cas9-1 bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到 144 个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到 85 个(36.32%).本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒,转染后绿色荧光强度均极显著降低,CRISPR/Cas9 编辑存在多种编辑形式,而PE编辑除 15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换,表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑,为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础.

邱梅玉、张雪梅、张宁、徐鑫、刘明军

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新疆畜牧科学院生物技术研究所,农业农村部草食家畜遗传育种与繁殖重点实验室,新疆动物生物技术重点实验室,新疆乌鲁木齐 830000

CRISPR-cas9 引导编辑(PE) eGFP基因 FITC-A-Mean Hi-TOM深度测序

新疆维吾尔自治区重点实验室开放基金新疆维吾尔自治区自然科学基金天山英才培养计划青年托举人才项目(第二批)

2021D040012022D01B1762023TSYCQNTJ0021

2024

10.19556/j.0258-7033.20230517-03

中国畜牧杂志
中国畜牧兽医学会

中国畜牧杂志

CSTPCD北大核心
影响因子：0.704
ISSN：0258-7033
年,卷(期)：2024.60(5)
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