摘要
为了构建增强型eGFP(Enhanced GFP)基因CRISPR/Cas9 和引导编辑(Prime Editing,PE)相关载体,确定CRISPR/Cas9 和PE对eGFP基因的编辑效率,本研究通过生物信息学对eGFP基因进行靶位点分析,人工合成eGFP sgRNA/15 bp缺失的pegRNA及niRNA,构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒;培养 293T细胞,利用荧光倒置显微镜、流式细胞仪和Hi-TOM深度测序,检测eGFP基因的FITC-A-Mean和细胞发生的编辑类型,同时预测不同编辑类型蛋白结构变化.结果发现,eGFP-sgRNA组的FITC-A-Mean显著低于阴性对照组;eGFP-PE2 组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;eGFP-PE3b组的FITC-A-Mean极显著低于阴性对照组;Hi-TOM测序表明eGFP-sgRNA、eGFP-PE2 和PE3b的编辑效率分别为 20.420%、36.735%和 40.180%;PE3b较PE2 编辑效率提升 3.445%;eGFP野生型蛋白二级结构中延伸链最多达到 83 个(34.73%),eGFP-CRISPR/Cas9-1 bp插入蛋白二级结构中无规则卷曲达到 144 个(56.69%);eGFP-PE-15 bp缺失蛋白中延伸链最多达到 85 个(36.32%).本试验成功构建LentiCRISPRV2-eGFP sgRNA、15 bp缺失的pU6-eGFP-pegRNA和U6-eGFP-niRNA质粒,转染后绿色荧光强度均极显著降低,CRISPR/Cas9 编辑存在多种编辑形式,而PE编辑除 15 bp缺失的精准编辑外存在比例较少的碱基替换,表明利用PE编辑系统可以实现精准编辑,为研究动物功能基因和精准分子育种领域奠定基础.
基金项目
新疆维吾尔自治区重点实验室开放基金(2021D04001)
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01B176)
天山英才培养计划青年托举人才项目(第二批)(2023TSYCQNTJ0021)
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