摘要
本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体,以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEND)炎性反应中的作用.使用 1 μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型,qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化;设计 2 对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列和 1 对无义序列,退火后分别连接至pCD513B-U6 载体构建 3 个重组质粒,随后进行酶切和测序鉴定.将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒,获得病毒颗粒后用其感染BEND,2 μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率.LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞,采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的表达变化.结果表明:LPS处理BEND后,IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高,表明BEND炎性反应模型构建成功.同时,LPS处理后,生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高,提示其可能参与BEND炎性反应的调控;成功构建 2 个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1 和sh2,WB结果显示,sh1 和sh2 均能有效降低NR1D1的表达,其中sh2 的干扰效果最好,使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2 的敲低细胞系;LPS处理后,炎症因子在sh2 细胞系中的表达显著高于shn组.本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体,通过转染BEND细胞,筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系,发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用,为后续深入探究NR1D1 在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础.
基金项目
国家自然科学基金面上项目(32373088)
西北农林科技大学大学生创新创业训练项目(X202310712177)
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