生物钟核受体NR1D1在奶牛子宫内膜上皮细胞炎性反应中的作用

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中文摘要：本研究旨在构建并筛选干扰效率高的奶牛NR1D1基因慢病毒干扰载体，以探究生物钟核受体NR1D1在大肠杆菌脂多糖(LPS)诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞(BEND)炎性反应中的作用。使用 1 μg/mL LPS处理BEND 12 h建立炎性反应模型，qPCR检测炎症因子与生物钟基因的表达变化;设计 2 对靶向奶牛NR1D1基因的特异性短发夹RNA(shRNA)序列和 1 对无义序列，退火后分别连接至pCD513B-U6 载体构建 3 个重组质粒，随后进行酶切和测序鉴定。将酶切测序鉴定均无误的重组质粒与辅助质粒共转染至HEK293T细胞包装慢病毒，获得病毒颗粒后用其感染BEND，2 μg/mL嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞系并使用qPCR和WB鉴定干扰效率。LPS处理NR1D1敲低组与对照组BEND细胞，采用qPCR技术检测炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β mRNA的表达变化。结果表明:LPS处理BEND后，IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子显著升高，表明BEND炎性反应模型构建成功。同时，LPS处理后，生物钟核受体NR1D1 mRNA表达量显著升高，提示其可能参与BEND炎性反应的调控;成功构建 2 个NR1D1基因慢病毒干扰载体sh1 和sh2，WB结果显示，sh1 和sh2 均能有效降低NR1D1的表达，其中sh2 的干扰效果最好，使用嘌呤霉素筛选成功获得sh2 的敲低细胞系;LPS处理后，炎症因子在sh2 细胞系中的表达显著高于shn组。本研究成功构建了奶牛NR1D1基因的慢病毒干扰载体，通过转染BEND细胞，筛选并成功获得了NR1D1敲低的稳定细胞系，发现NR1D1在LPS诱导的BEND炎性反应中可能发挥抑制促炎因子表达的作用，为后续深入探究NR1D1 在奶牛子宫内膜炎发生发展过程中的作用机制提供前期基础。

作者：

郭怡莹、王雪容、杨王浩、曹梦丹、张海森、靳亚平、陈华涛

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作者单位：

西北农林科技大学动物医学院,陕西杨凌 712100

农业农村部动物生物技术重点实验室,陕西杨凌 712100

关键词：

奶牛 NR1D1基因子宫内膜炎慢病毒 RNA干扰

基金：

国家自然科学基金面上项目西北农林科技大学大学生创新创业训练项目

项目编号：

32373088X202310712177

出版年：

2024

DOI：

10.19556/j.0258-7033.20231122-03

中国畜牧杂志

中国畜牧兽医学会

中国畜牧杂志

CSTPCD北大核心

影响因子：0.704

ISSN：0258-7033

年,卷(期)：2024.60(9)