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农林有害生物基因调控技术研究

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本研究利用寄主诱导的基因沉默原理,选择RSV侵染过程中起重要作用的CP基因构建RNAi载体,获得能稳定遗传、表达RSV-CP 发夹结构的转基因水稻T1代株,其中单拷贝插入2株。构建了针对RSV CP mRNA的两种TAS结构, Northern blot和qRT-PCR分析结果表明TAS结构可以有效地降低RSV CP的积累量。通过免疫荧光标记技术系统分析了水稻条纹病毒和水稻草状矮缩病毒在其介体昆虫体内的时空分布,明确病毒在体内的侵染循回过程。利用RNAi原理将源于南方水稻黑条矮缩病毒S9基因的人工microRNA转入日本晴水稻获得了转基因水稻株系,通过2龄白背飞虱取食转基因水稻后获毒并检测昆虫的带毒率,初步结果表明白背飞虱取食转基因水稻后可抑制病毒对昆虫的侵染,为控制南方水稻黑条矮缩病毒提供了新的途径。建立了dsRNA介导的沉默应用及沉默效果评价体系,通过生物信息学及分子生物学试验明确了镰刀菌中沉默参与基因及机制。已初步分析了521个镰刀菌的基因功能,并筛选出能应用于HIGS抗番茄枯萎病菌的靶基因FoSTE12和FoSGE1。基于烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus) TRV-VIGS技术,改进了番茄植株上瞬时表达针对靶基因的dsRNA沉默技术,为下一步基于HIGS技术的培育抗枯萎病的番茄新种质奠定基础。利用寄主诱导的基因沉默原理,创制并获得能稳定遗传、表达稻瘟病菌关键致病基因GAS2、PTH11、PMK1、MPS1、Mst12等反义mRNA的转基因水稻T1代株系53个。离体接种试验表明,表达稻瘟病菌致病基因反义RNA或RNAi片段的转基因水稻提高对稻瘟病的抗性,接种后稻瘟病病斑变小。同时,研究了水稻OsBIERF3基因在抗病抗虫中的功能,结果表明超表达OsBIERF3的转基因水稻植株提高对稻瘟病、白叶枯病和飞虱抗性中的抗性,而OsBIERF3 RNAi株系则降低对稻瘟病、白叶枯病和飞虱抗性中的抗性。以B型烟粉虱TOLL样受体基因7(TLR7)为目的基因,利用pSilent-1质粒构建含TLR7基因片断的正反向载体psTLR7,通过聚乙二醇(PEG4000)介导转化玫烟色棒束孢霉野生菌株IfB01的原生质体,最后通过筛选获得了一种重组菌株IfB01-TRL7。该重组菌株侵染烟粉虱后,能够沉默其TLR7基因的转录,对2龄烟粉虱若虫的致病力比原始菌株显著提高,杀虫速度更快。丰富了小菜蛾基因组数据库(DBM-DB)和小菜蛾高密度遗传图谱。构建了小菜蛾AK基因RNAi载体,通过农杆菌菌液侵染四九菜心,经共培养、脱菌培养、潮霉素筛选、继代培养后共获得4株表达AK基因发夹结构的转基因植株。

周雪平、宋凤鸣、尹燕妮、杨广、胡琼波

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福建农林大学

华南农业大学

基因沉默 抗病毒 番茄枯萎病菌 稻瘟病菌 烟粉虱

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进展报告

2014-11-25

2012