查看更多>>摘要:[目的]克隆黄喉拟水龟(Mauremys mutica)干扰素刺激基因15(ISG15)并分析其表达特征,为探究ISG15蛋白在黄喉拟水龟抗病原微生物侵袭过程中的免疫功能和作用机制提供理论依据.[方法]应用RACE克隆黄喉拟水龟ISG15基因(MmISG15)cDNA全长序列,进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR检测MmISG15基因在健康黄喉拟水龟不同组织中的表达情况,并检测黄喉拟水龟受脂多糖(LPS)、多肌胞苷酸[Poly(I∶C)]和肺炎克雷伯氏菌刺激后,MmISG15基因的表达变化,以PBS为对照.[结果]MmISG15基因cDNA序列全长1274 bp,5'端非编码区(5'-UTR)与3'端非编码区(3'-UTR)分别为126和650 bp,开放阅读框(ORF)为498 bp,编码165个氨基酸残基,蛋白分子量为15.3 kD,理论等电点(pI)为7.70.MmISG15蛋白N端存在2个泛素样结构域(UBD),C端含有1段高度保守的LRLRGG基序.MmISG15氨基酸序列与其他爬行动物ISG15氨基酸序列相似性为55.57%~95.54%,与鱼类和哺乳动物的相似性分别为34.09%~49.02%及38.64%~48.25%.系统发育进化树显示,MmISG15和其他爬行动物ISG15聚为一支,其中与乌龟(Mauremys reevesii)亲缘关系最近.实时荧光定量PCR检测结果表明,MmISG15基因在健康黄喉拟水龟8种组织中均有表达,在脾脏组织中相对表达量最高,其次是肝脏,在前肠、后肠、肾脏、肺和肌肉组织中的相对表达量较低,而在脑组织中的相对表达量最低;LPS刺激后黄喉拟水龟脾脏和肝脏组织中MmISG15基因相对表达量与对照无显著差异(P>0.05);Poly(I∶C)刺激后6 h脾脏和肝脏组织中MmISG15基因相对表达量极显著上调(P<0.01,下同)并在刺激后12 h达最大值;肺炎克雷伯氏菌刺激后12 h脾脏和肝脏组织中MmISG15基因相对表达量极显著上调并在刺激后48 h达最大值.[结论]MmISG15属于典型泛素样蛋白,MmISG15基因主要在黄喉拟水龟脾脏和肝脏组织中表达.Poly(I∶C)和肺炎克雷伯氏菌刺激能提高脾脏和肝脏中MmISG15基因的相对表达量,推测MmISG15基因参与黄喉拟水龟抵抗病毒和细菌侵袭的免疫反应,其编码蛋白发挥重要免疫功能.