查看更多>>摘要:钙调神经磷酸酶(CN)属苏/丝氨酸蛋白磷酸酶,在软体动物的抗菌应答、免疫调节中发挥重要作用.本研究利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得三角帆蚌CN基因α型催化亚基(HcCnAα)的cDNA序列,并进行了生物信息学分析.构建pET30α-HcCnAα原核表达载体,将诱导表达、纯化、复性后蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体.用蛋白质印迹法(Western blot,WB)和荧光定量PCR(qPCR)技术分析健康状态和感染维氏气单胞菌GL2后HcCnAα在三角帆蚌不同组织中的表达情况.结果显示,HcCnAαcDNA 全长 2 737 bp,其中 3'UTR 长 131 bp,5'UTR 长 1 154 bp,CDS 区为 1 452 bp,编码483个氨基酸,序列包含蛋白磷酸酶保守的PP2Ac结构域.WB和qPCR结果显示,HcCnAα在三角帆蚌各组织中广泛存在,并在闭壳肌、斧足、性腺、鳃中的表达量较高,在血液中的表达量最低.维氏气单胞菌GL2感染三角帆蚌后3~24h,鳃中HcCnAα的表达量显著升高,6h时闭壳肌中表达量也显著升高,感染后24h,肝胰腺、斧足、血液、外套膜中的表达量显著升高.而感染后48h,闭壳肌、鳃、外套膜、肝胰腺中的表达量显著降低.研究表明,三角帆蚌HcCnAα基因与其他物种CnAα基因高度相似,具有保守的PP2Ac结构域,在各组织中普遍表达,并参与了三角帆蚌在细菌感染后的免疫反应.本研究首次克隆了三角帆蚌HcCnAα基因并制备了多克隆抗体,揭示了 HcCnAα基因参与三角帆蚌的抗感染免疫应答,为深入研究三角帆蚌的免疫调控机制和疾病防控策略奠定了基础.