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生物工程学报
生物工程学报

杨胜利

月刊

1000-3061

cjb@im.ac.cn

010-64807509

100101

北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所B401

生物工程学报/Journal Chinese Journal of BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《生物工程学报》是国内外公开发行的全国性学术期刊, 由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。栏目设有：综述、研究报告、研究简报、技术与方法等。《生物工程学报》创刊于1985年。20多年来，本刊始终以推动生命技术发展和促进国家经济建设为宗旨，及时报道我国生物工程方面的重要研究成果, 有力地促进了国内在这一领域的学术交流，为科研教学和经济建设发挥了积极的作用。本刊已被美国<CA>,<BA>，<MEDLINE>,及<俄罗斯文摘>、中国生物学文摘、中国科学引文数据库、万方数据库、中国科技期刊光盘版等检索系统收录，是中国自然科学核心期刊。
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    海藻糖强化高盐胁迫下异养硝化-好氧反硝化菌群的代谢机制

    郭雷肖芃颖李龙山陈爽...
    4536-4552页
    查看更多>>摘要：异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD)菌是一类可在高盐环境脱氮的好氧微生物,但其工程应用效果不理想.海藻糖作为相容性溶质,通过参与调节细胞渗透压帮助微生物抵抗高盐胁迫,对提升高盐环境菌群的脱氮效率起重要作用.本研究通过启动膜曝气生物膜反应器(membrane aerobic biofilm reactor,MABR)富集HN-AD菌,设计添加150μmol/L海藻糖的C150实验组和未添加海藻糖的C0对照组,开展了外源性海藻糖对高盐胁迫下HN-AD菌群代谢的强化机制研究.反应器运行性能及群落结构分析结果显示,C150组相较C0组,NH4+-N、总氮(total nitrogen,TN)和化学需氧量(chemical oxygen demand,COD)去除率分别提高29.7％、28.0％和 29.1％;以不动杆菌属(Acinetobacter)和假黄褐藻属(Pseudofulvimonas)为优势菌属的耐盐型HN-AD菌群总相对丰度在C150组达到66.8％、较C0组提高了 18.2％,添加海藻糖促进高盐环境中耐性型HN-AD菌群富集并强化系统脱氮性能.代谢组学深度分析表明,外源性海藻糖加强脯氨酸合成,提高微生物对高盐胁迫的抵抗能力;通过调节细胞增殖信号通路(cGMP-PKG、PI3K-Akt)、磷脂代谢通路及氨酰基-tRNA合成通路的活性,促使甘油磷脂代谢物磷酸乙醇胺及嘌呤和嘧啶丰度上调,提升细菌聚集能力和细胞增殖,助推微生物在高盐环境生长;同时,添加海藻糖还加快三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle),为HN-AD菌群的碳、氮代谢提供更多电子供体与能量，进而优化系统脱氮性能.本研究结果为HN-AD菌在高盐高氮废水处理中的运用提供理论指导.

    高盐胁迫海藻糖异养硝化-好氧反硝化群落结构微生物代谢

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    高活性酪氨酸解氨酶的表征及其在对香豆酸生物合成中应用

    黄雅文江小龙陈五九张桂敏...
    4553-4566页
    查看更多>>摘要：对香豆酸(p-coumaric acid)具有抗菌、抗氧化和预防心血管疾病的作用,也是许多重要化合物的前体或中间体,被广泛应用于食品、化妆品和医药等领域.酪氨酸解氨酶(tyrosine ammonia-lyase,TAL)能直接催化酪氨酸脱氨生成对香豆酸.然而,缺少高活性和高底物耐受性的酪氨酸解氨酶限制了对香豆酸的高效生物合成.为了提高对香豆酸的合成能力,本研究挖掘了 2个黄杆菌来源的酪氨酸解氨酶,分别是柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)来源的Fc-TAL2和顺天黄杆菌(Flavobacterium suncheonense)来源的Fs-TAL.异源表达纯化表征分析显示,Fc-TAL2和Fs-TAL的最适温度和最适pH相同,分别为55℃、pH 9.5.在最适条件下,Fs-TAL的比酶活为82.47 U/mg,而Fc-TAL2的比酶活为13.27 U/mg.结构模拟和比对分析显示,内盖环上保守的Y50残基酚羟基朝向和到底物的距离是造成Fs-TAL活性高于Fc-TAL2的主要原因.全细胞催化研究进一步证实Fs-TAL具有较高活性和特异性,能够催化10 g/L酪氨酸生成6.2 g/L对香豆酸,产率达到67.9％.该研究丰富了酪氨酸解氨酶的酶资源,促进了对香豆酸及其衍生物的生产.

    对香豆酸酪氨酸解氨酶基因挖掘全细胞催化

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    基于碳硫模块平衡策略的大肠杆菌高产L-半胱氨酸菌株构建

    张博陈开杨辉吴梓丹...
    4567-4586页
    查看更多>>摘要：L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,因其多样的生理功能,L-半胱氨酸在医药、化妆品和食品工业中有着广泛的应用.模块化代谢工程策略在细胞工厂的构建中具有极大的潜力.本研究利用碳硫模块协同表达策略进行大肠杆菌的L-半胱氨酸合成途径构建,构建了一株L-半胱氨酸合成基因工程菌.首先,通过增强L-半胱氨酸前体物质L-丝氨酸(serAf、serB和serCCg)的生物合成以及转录调控因子CysB的表达,L-半胱氨酸的产量由0提高到(0.38±0.02)g/L.然后,通过促进L-半胱氨酸转运和无机硫源的吸收同化、减弱L-半胱氨酸和L-丝氨酸的降解以及异源表达cysEf和cysBSt,L-半胱氨酸的产量提升至(3.82±0.01)g/L.最后,为了优化碳模块和硫模块的代谢通量,协同表达硫酸盐同化途径与硫代硫酸盐同化途径的基因cysM、nrdH、cysK以及cysIJ,得到L-半胱氨酸高产菌株.在500 mL摇瓶和2 L发酵罐中分别实现了(4.17±0.07)g/L和(11.94±0.1)g/L的L-半胱氨酸积累.研究结果表明,在细胞内通过对硫碳模块间代谢通量的协调控制,可以实现L-半胱氨酸的高效生物合成.研究结果为微生物发酵生产L-半胱氨酸的产业化奠定了基础.

    生物合成基因协同表达L-半胱氨酸代谢工程发酵工程

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    分子串联重复策略用于制备超短肽

    赵晨李端华李进军王辂...
    4587-4600页
    查看更多>>摘要：超短肽具有更好的稳定性、组织渗透性、生物相容性以及更低的免疫原性.GHK(glycyl-L-histidyl-L-lysine)和 GQPR(glycyl-L-glutamyl-L-prolyl-L-arginine)具有刺激胶原蛋白产生、减缓胶原蛋白降解的作用,作为抗皱成分广泛应用于化妆品.超短肽一般都是通过固相合成方法制备,其缺陷是制备过程中大量使用有机化学试剂而造成环境负担,故本文探讨了一种设计和制备超短肽的新方法.因序列短而无法直接重组表达,文中首先构建了适用于融合表达的载体骨架pET28a-Trxm.以GHK和GQPR串联重复基因作为滚环扩增的基本单元(tandem repeat of short peptides,TRSP),反应时随机掺入5-甲基胞嘧啶获得长基因片段,然后经Acc65 Ⅰ和ApaⅠ消化产生随机长度的基因.胶回收500 bp到1 500 bp的DNA片段,克隆得到表达载体pET28a-Trxm-(TRSP)n并转化获得重组菌.双酶切及测序结果表明,成功构建获得串联重复数n=1、2、3、4、6、7、8、9的阳性克隆.蛋白表达结果显示,当串联重复数n=l、2、3、4、8、9时均有相应融合蛋白表达,表达水平随着重复数增加而降低.Trxm-(TRSP)1表达水平最高,达总蛋白的50％,而Trxm-(TRSP)2表达水平为总蛋白的30％.进一步地,含Trxm-(TRSP)1的清液先后经肠激酶和胰蛋白酶切割后,HPLC分析结果表明,成功获得超短肽GHK和GQPR.该结果对于超短肽重组制备的工业化应用具有重要价值.

    串联重复基因滚环扩增超短肽融合蛋白重组制备

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    半理性设计提高产碱杆菌KS-85来源的肌酸酶催化活性

    卞佳豪郝俊尧杨广宇
    4601-4614页
    查看更多>>摘要：肌酐水平是指示肾脏功能的重要临床指标.肌酸酶(creatinase,CRE)是肌酐的酶促检测体系中的关键酶之一,也是整个体系的限速酶,较差的活性限制了它在临床检测和工业上的应用.针对此问题,采用半理性设计策略对产碱杆菌属(Alcaligenes sp.)KS-85来源肌酸酶Al-CRE的活性进行了改造,通过对挑选出的突变热点进行饱和突变筛选和组合,最终获得多个活性提升的突变酶,活性最高的五点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S/Q88A比活力相较于野生型提升了2.18倍.同时对相关突变位点进行了结构分析,为肌酸酶的实际应用及对其机理的进一步解析提供了基础.

    肌酐肌酸酶半理性设计饱和突变

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    大肠杆菌转酮醇酶分子改造及催化酒石酸半醛合成

    王剑峰李文英辛振麒冯文娜...
    4615-4629页
    查看更多>>摘要：转酮醇酶(transketolase,TK,EC.2.2.1.1)是一种焦磷酸硫胺素和二价阳离子依赖性酶,可催化二碳单位的转移,可逆形成C-C键,在多酶催化生产化学品、药物前体和不对称合成方面有广泛应用.文中以大肠杆菌(Escherichia coli)K12转酮醇酶TKTA为研究对象,通过定点饱和突变和组合突变提升对非磷酸化底物的反应活性,并探索突变酶TKTA_M催化合成酒石酸半醛.结果表明:突变酶TKTA_M(R358I/H461S/R520Q)最适反应温度为32℃,最适反应pH为7.0,以D-甘油醛为受体底物的比酶活为(6.57±0.14)U/mg,是野生型比酶活((0.71±0.02)U/mg)的9.25倍.在酶学性质研究的基础上,设计20 mL的反应体系,以50 mmol/L5-酮基-D-葡萄糖酸和50 mmol/L非磷酸化乙醇醛为底物,TKTA_M催化合成酒石酸半醛,最终酒石酸半醛的产量为3.71 g,摩尔转化率为55.34％.研究结果为生物质制备L-(+)-酒石酸提供数据支撑,同时为转酮醇酶催化非磷酸化底物提供了借鉴.

    转酮醇酶定点突变酶学性质生物催化

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    基于前体供给途径遗传改造提高褐黄孢链霉菌纳他霉素的产量

    孔德真李浩李晓杰谢周杰...
    4630-4643页
    查看更多>>摘要：纳他霉素(natamycin)是一种高效、广谱、安全的抗真菌剂,广泛应用于食品防腐与医药领域.纳他霉素可由多种链霉菌发酵产生.它是以乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A及甲基丙二酰辅酶A为前体经Ⅰ型聚酮合酶(polyketide synthase,PKS)催化合成的多烯大环内酯类化合物.本研究以纳他霉素产生菌——褐黄孢链霉菌为研究材料,分别对不同前体分子供给途径中的关键酶进行过表达,并确定影响纳他霉素产量的关键前体供给途径.研究结果发现:通过过表达乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthase,ACS)加强乙酰辅酶A合成途径,以及通过过表达甲基丙二酰辅酶A变位酶(methylmalonyl-CoA mutase,MCM)加强甲基丙二酰辅酶A合成途径,重组菌株纳他霉素产量分别比野生型菌株提高了 44.19％和20.51％.共过表达ACS和MCM,重组菌株纳他霉素产量获得进一步提升(达1 123.34 mg/L),比野生型菌株提高了 66.29％.上述发现为通过前体代谢工程的策略构建纳他霉素工业高产菌株提供了参考,也为其他聚酮类天然产物高产工程菌株的构建提供了借鉴.

    褐黄孢链霉菌纳他霉素前体供给乙酰辅酶A合成酶甲基丙二酰辅酶A变位酶

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    嗜热古菌Infirmifilum uzonense来源的双功能高温β-葡萄糖苷酶IuBgl3的原核表达及酶学性质分析

    刘鑫涵沈风飞石鹏君刘慧芹...
    4644-4657页
    查看更多>>摘要：β-葡萄糖苷酶在食品、医药、生物质转化等领域具有重要的应用价值,因此发掘适应性强、性质优良的β-葡萄糖苷酶是国内外研究热点.本研究从嗜热古菌Infirmifilumuzonense中成功克隆出一个GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,命名为Iubgl3.基因序列分析显示Iubgl3全长为2 109 bp,编码702个氨基酸,理论分子量为77.0 kDa.将该基因在大肠杆菌中进行克隆表达并对纯化后的IuBgl3进行酶学性质研究.结果显示,重组酶IuBgl3最适pH 5.0,最适温度85℃.该酶具有良好的热稳定性,80℃处理2 h后仍能保持85％以上的酶活力.其具有优良的pH稳定性,在pH 4.0-11.0范围内处理1 h,仍维持85％以上的酶活力.通过底物特异性测定发现,该酶对对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl β-D-glucoside,pNPG)和对硝基苯-β-D-吡喃木糖苷(p-nitrophenyl β-D-xylopyranoside,pNPX)均有很高的水解能力,是典型的双功能酶.以pNPG为底物时的动力学参数Km和Vmax分别为0.38 mmol和248.55 μmol/(mg·min),催化效率kcat/Km=6 149.20 s-1mmol-1.大多数金属离子对IuBg13的酶活力没有显著影响,SDS可导致酶完全失活,而EDTA却能提高30％的酶活力.本研究丰富了高温古菌GH3家族的β-葡萄糖苷酶基因,获得了一个稳定性优良的高温酸性双功能酶,具有良好的工业应用前景.

    嗜热古菌GH3家族β-葡萄糖苷酶酶学性质双功能酶

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    杓兰果胶杆菌海藻糖酶的克隆表达及应用

    高涵龚劲松汪子凯苏畅...
    4658-4668页
    查看更多>>摘要：海藻糖酶在工业发酵和食品医药等领域应用广泛,我国缺乏性能优良工业品种的海藻糖酶,同时在应用研究领域还不够深入.本研究从自然界筛选获得一株产酸性海藻糖酶的杓兰果胶杆菌(Pectobacterium cypripedii),克隆获得其海藻糖酶基因PCTre,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)体系中实现了重组表达,在5L发酵罐上28h产酶达到4 130U/mL.酶学性质研究显示,PCTre能特异性水解海藻糖,最适反应温度和pH分别是35℃和5.5,在pH 4.0、4.5、5.0处理8 h后残余酶活仍超过80％,表现出良好的耐酸性.同时该酶还显示出优良的有机溶剂耐受性,在20％(V/V)乙醇溶液中处理24 h仍能保留60％的酶活.进一步在含有20％(V/V)乙醇和7.5％海藻糖的模拟发酵体系中,当添加500 U/L PCTre,可在16 h内完全水解海藻糖,具有良好的应用于工业乙醇发酵的潜力.

    海藻糖酶海藻糖杓兰果胶杆菌乙醇耐受性

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    来源于泗阳鞘氨醇杆菌的聚磷酸激酶的克隆表达及在ATP再生系统中的应用

    黄欣李益民杜聪袁文杰...
    4669-4680页
    查看更多>>摘要：聚磷酸激酶(polyphosphate kinase,PPK)在体外催化合成ATP的反应中有着重要作用.为寻找能利用短链聚磷酸盐(polyphosphate,polyP)为底物高效合成ATP的聚磷酸激酶,本文以来源于泗阳鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium siyangensis)的聚磷酸激酶(PPK2)为研究目标,利用pET-29a构建重组质粒,在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)中表达,并将其作为ATP再生系统的关键酶与L-氨基酸连接酶(YwfE)联用生产丙谷二肽(Ala-Gln).ppk2长度为810 bp,编码270个氨基酸;SDS-PAGE结果表明PPK2为可溶性表达,分子量为29.7 kDa.对PPK2的最适反应条件进行了优化,结果发现其在22-42℃、pH 7-10的范围内均可以保持较好活性,且在37℃、pH为7、镁离子(Mg2+)浓度为30 mmol/L、底物ADP与六偏磷酸钠浓度分别为5 mmol/L和10mmol/L时酶活最大,在0.5 h时ATP产率可以达到理论值的60％以上.作为模式反应体系,当PPK2与YwfE联用生产Ala-Gln时,达到与直接添加ATP相同的效果.此聚磷酸激酶作为ATP再生系统具有较好的适用性,适用的温度和pH范围广,且能以廉价易得的短链polyP为底物高效合成ATP,为依赖ATP的催化反应体系的能量再生提供了新酶的来源.

    泗阳鞘氨醇杆菌聚磷酸激酶ATP再生双酶偶联二肽

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