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生物工程学报
生物工程学报

杨胜利

月刊

1000-3061

cjb@im.ac.cn

010-64807509

100101

北京朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所B401

生物工程学报/Journal Chinese Journal of BiotechnologyCSCD北大核心CSTPCD
查看更多>>《生物工程学报》是国内外公开发行的全国性学术期刊, 由中国科学院微生物研究所和中国微生物学会共同主办。主要报道生物工程研究的新发展、新成果、新技术。刊登的内容包括：基因工程、细胞工程、酶工程、生化工程、组织工程、生物信息、生物制药、生物芯片等。栏目设有：综述、研究报告、研究简报、技术与方法等。《生物工程学报》创刊于1985年。20多年来，本刊始终以推动生命技术发展和促进国家经济建设为宗旨，及时报道我国生物工程方面的重要研究成果, 有力地促进了国内在这一领域的学术交流，为科研教学和经济建设发挥了积极的作用。本刊已被美国<CA>,<BA>，<MEDLINE>,及<俄罗斯文摘>、中国生物学文摘、中国科学引文数据库、万方数据库、中国科技期刊光盘版等检索系统收录，是中国自然科学核心期刊。
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    利用多基因缺失型杆状病毒在昆虫细胞中生产腺相关病毒

    张峒蒋卓含吴奕凡李倩茹...
    473-484页
    查看更多>>摘要：腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)是基因治疗领域最常使用的病毒载体之一,产量低、成本高是该产业面临的关键瓶颈问题.本研究旨在基于多基因缺失型杆状病毒,建立双病毒感染昆虫细胞以生产 AAV的技术体系.首先,进行 AAV生产用多基因缺失型重组杆状病毒的构建和扩增,并检测杆状病毒滴度及其感染细胞的效果;然后,使用双杆状病毒共感染昆虫细胞,并优化感染条件;最后,基于优化条件进行AAV生产,并检测评估产量、质量等相关指标.结果表明,AAV生产用多基因缺失型杆状病毒滴度较野生型无差异,感染后细胞存活率下降明显减缓.使用双病毒路线进行AAV优化生产,Bac4.0-1 的基因组滴度为 1.63×1011 VG/mL,Bac5.0-2 的基因组滴度为 1.02×1011 VG/mL,较野生型产量分别提升了 240%和 110%.电镜下,3 组均具有正常的AAV病毒形态,且转导活性相近.本研究建立了基于多基因缺失型杆状病毒感染昆虫细胞的AAV生产体系,显著提高了AAV产量,具有一定的应用价值.

    杆状病毒多基因缺失昆虫细胞腺相关病毒生产工艺

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    人博卡病毒1型感染性克隆的构建及鉴定

    杨暄苏丽芳王悦王媛...
    485-495页
    查看更多>>摘要：人博卡病毒 1(human bocaparvovirus 1,HBoV1)为感染人并引起疾病的两种细小病毒之一.其感染 2-5 岁婴幼儿,能引起轻度或重度急性呼吸道疾病,严重时可危及生命.HBoV1 基因组末端含末端反向重复序列(repeat the sequence in reverse,ITR),为病毒基因组复制所必需,但是难以进行PCR扩增合成.本研究通过分步合成末端ITR及分子克隆方法成功构建HBoV1 的全长感染性克隆pSKHBoV1.经转染HEK293 细胞后,分别从重要非结构蛋白的表达、病毒RNA转录后修饰与加工、病毒基因组复制水平以及子代病毒粒子基因组鉴定等方面,证实构建的感染性克隆在转染 HEK293 细胞后能够进入正常的复制周期并具有拯救出病毒粒子的潜力,这为后续研究HBoV1 的复制增殖、病毒与宿主互作关系以及病毒疫苗的研发奠定了基础.

    人博卡病毒感染性克隆人工合成病毒复制

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    新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定

    张锐闫浩浩刘志成刘晓丽...
    496-506页
    查看更多>>摘要：传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义.本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein,ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价.将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A1与RFP-B1基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒.将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子.重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物 ddRFP-M 的可溶表达,并以 HisTrapTM层析柱进行分离纯化.以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物 ddRFP-M 评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性.结果显示,荧光底物 ddRFP-M 在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性.新冠病毒 Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础.

    新冠病毒主蛋白酶荧光底物二聚化红色荧光蛋白恩赛特韦黄芩素

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    抗体成药性筛选流程及评价策略

    姚江宁律璎桐张迎珺张正平...
    507-516页
    查看更多>>摘要：自 1986 年OKT3 作为第一个治疗性单克隆抗体获批上市后,抗体技术及抗体药物迅猛发展.单克隆抗体、抗体片段、双(多)特异性抗体、融合蛋白、纳米抗体以及抗体偶联药物(antibody-drug conjugates,ADCs)等推陈出新,在肿瘤、血液、免疫、呼吸和代谢等相关疾病的治疗领域发挥着举足轻重的作用.抗体药物的发现过程,是通过多轮生物学功能评估和可成药性评估,筛选出具有安全、有效、稳定和可工艺放大的最佳候选序列,从而提高药物开发和临床研究的效率及成功率.抗体药物发现阶段的"成药性筛选与评估"已日益受到关注和重视,从药物发现和设计、先导分子筛选到候选分子确认,可及时发现分子潜在的物理化学风险因素,并评估可控性,保证后续药物开发过程中的质量稳定性.本文对抗体发现阶段的成药性筛选评估流程进行了分类和定义,涉及单克隆抗体、双特异性抗体、纳米抗体和ADCs等相关技术和药物形式,同时总结了成药性筛选评估中应重点关注的质量属性和高通量检测技术;系统性地阐述成药性开发流程和策略,为不断涌现的创新型药物的成药性筛选评估提供参考,大幅提高抗体药物开发的效率和成功率.

    抗体发现成药性筛选与评估高通量检测技术

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    体外重构STUB1介导α-1抗胰蛋白酶突变体Z蛋白泛素化修饰反应体系

    凌雪代艳叶晓张肖雅...
    517-528页
    查看更多>>摘要：α-1 抗胰蛋白酶Z型突变体蛋白(α-1 antitrypsin Z-mutant protein,ATZ)是引发α-1 抗胰蛋白酶缺陷症(α-1 antitrypsin deficiency,AATD)的主要原因,研究ATZ蛋白的泛素化修饰和降解对于治疗AATD具有重要意义.STUB1 是一种重要的E3 泛素连接酶,参与调节多种蛋白质的泛素化修饰.然而,STUB1 是否参与ATZ的泛素化修饰尚未明确.本研究首先将ATZ和STUB1 的编码基因克隆到pET28a质粒,构建了这2个蛋白的表达质粒.随后,将重组质粒转入大肠杆菌表达系统,在优化诱导条件实现了重组蛋白的异源表达.通过金属螯合亲和层析技术纯化得到目的蛋白,并通过蛋白质谱分析验证了其氨基酸序列的准确性.利用纯化的ATZ和STUB1 重组蛋白,构建了一个体外泛素化修饰反应体系.实验结果显示,在 ATP、E1 泛素激活酶和 E2 泛素结合酶的协同作用下,STUB1成功催化了ATZ的泛素化修饰.本研究提供了一种体外获得Z型突变体ATZ纯化蛋白的方法,并确认了 STUB1 介导 ATZ的泛素化修饰功能,推进了对 α-1 抗胰蛋白酶 Z型突变体蛋白在细胞内降解过程的调控机制的理解.

    α-1抗胰蛋白酶泛素化E3泛素连接酶蛋白纯化蛋白酶体

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    桑根酮C通过促进β-catenin的泛素化水平抑制胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力

    翁雪莲侯建兵常洪博崔红娟...
    529-541页
    查看更多>>摘要：胶质母细胞瘤属于浸润性的恶性肿瘤,目前其化疗新药物的寻找和治疗仍待突破.桑根酮C(Sanggenon C,SC)来源于桑白皮,在多种癌症中发挥着抗肿瘤功效.本研究利用显微镜拍摄、transwell 实验和免疫荧光实验验证了 SC 对胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力的影响;基因富集、实时荧光定量PCR(real-time qPCR)以及泛素化实验用于阐明SC抑制胶质母细胞瘤迁移侵袭能力的分子机制.显微镜拍摄结果显示,对胶质母细胞瘤进行加药处理后细胞形态明显回缩,细胞迁移侵袭能力被削弱;Transwell实验和免疫荧光实验也验证了SC能抑制胶质母细胞瘤迁移侵袭能力的猜测;基因富集实验结果表明 SC 可能调控迁移侵袭相关基因的表达,并且影响 Wnt/β-catenin 信号通路的活性;Western blotting揭示了SC可调控β-catenin的泛素化水平,并且抑制β-catenin及其下游蛋白的表达;Real-time qPCR 实验结果在转录水平上佐证 Western blotting 的结果.SC 通过调控β-catenin的泛素化水平抑制胶质母细胞瘤的迁移侵袭能力,为胶质母细胞瘤的治疗提供了新的思路.

    胶质母细胞瘤桑根酮C迁移侵袭β-catenin泛素化

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    基于转录组学和代谢组学联合分析草珊瑚萜类化合物生物合成的组织特异性分布

    吴迪张燕燕林楠魏艺聪...
    542-561页
    查看更多>>摘要：本研究旨在探究草珊瑚叶和根中萜类化合物的组织特异性分布差异,解析其药效品质差异形成的分子机制.采用液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和Illumina HiSeqTM高通量测序技术获得草珊瑚[Sarcandra glabra(thunb)naka]叶和根的代谢组学和转录组学数据.代谢组学结果表明参与叶和根中萜类合成的差异代谢物有 50 个,包括法尼西基半胱氨酸、甘油醛-3-磷酸、甲羟戊酸-5-磷酸等.转录学结果表明差异代谢酶基因有 57 条,包括ACTC、HMGCR、MVK、DXS与KS等,并预测了MYB、C2H2、AP2/ERF-ERF等 7 个转录因子参与调控草珊瑚不同组织部位中萜类的合成和积累差异.实时荧光定量 PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)结果显示,随机选取的 8 个参与萜类合成的酶基因在草珊瑚不同组织部位中的表达趋势与转录组学测序结果一致.本研究有助于阐明草珊瑚叶和根临床疗效差异形成的分子机制,同时为草珊瑚的资源开发利用奠定基础.

    草珊瑚萜类代谢组学转录组学

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    基于壳聚糖的搭载光源可溶性微针的制备与评价

    刘俸溢庄俭薛庆隆许红...
    562-572页
    查看更多>>摘要：光动力疗法与给药微针(microneedle,MN)相结合为治疗肿瘤提供了一种安全有效的途径.本文设计了一种基于壳聚糖搭载高能光子的可控缓释型载药微针贴片(LED-losartan-HEMA/CS-MN,LLH-CSMN),重点研究了其制备工艺,并且以氯沙坦为模型药物对微针阵列的形貌尺寸进行了表征,探究了 LLH-CSMN 的力学性能、皮肤穿刺性能、缓释性能以及高能光子在长时间工作下的光热性能.结果表明,基于壳聚糖搭载高能光子的微针贴片能够有效地在皮肤表面打开通道进行药物递送,并进行光动力治疗.同时,体外透皮扩散试验表明,以氯沙坦为模型药物制备的微针在1 h内释放了约30%的药物,在1 d内总共释放了约60%的药物,随后进行缓慢释放,在 6 d 后最终释放了 93%的药物,LLH-CSMN 具有可控缓释特性以及良好的长效光辅助治疗效果,为肿瘤治疗提供了一个新的安全有效途径.

    光动力治疗壳聚糖微针药物缓释肿瘤

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    定点突变优化信号肽对嵌合抗原受体T细胞功能的影响

    刘玉李帆戴蕙芸周润龙...
    573-584页
    查看更多>>摘要：信号肽(signal peptide,SP)参与调节嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)结构的分泌水平及跨膜易位过程,对嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)行使功能至关重要,本研究通过定点突变技术优化 SP 序列,并研究其对 CD19-CAR-T 杀伤功能的影响.首先,利用基因合成和分子克隆技术,构建含野生型SP(SP-wtY)、2种突变型SP(SP-muK或SP-muR)的靶向CD19 的CAR载体;对构建成功的载体进行慢病毒包装,并使用慢病毒侵染T细胞,利用流式细胞术检测细胞的转染效率,钙黄绿素释放法检测对靶细胞的体外杀瘤能力,酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技术检测 2 种细胞因子[干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和干扰素-α(interferon-α,TNF-α)]的分泌水平.结果显示,构建了野生型和信号肽突变的重组慢病毒质粒,慢病毒转导T细胞后,携带 3 种信号肽(SP-wtY、SP-muK或SP-muR)的CD19-CAR转染效率分别为 33.9%、35.5%、36.8%.进一步杀伤实验显示,与SP-muK和SP-wtY细胞相比,SP-muR细胞的肿瘤杀伤效果显著提高,当效靶比为 10:1 时共培养 24 h后,SP-muR组CAR-T细胞的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌水平显著高于SP-muK和SP-wtY组.本研究揭示信号肽N端正电荷数的增加可以提高CAR的表达效率和对CD19+靶细胞的杀伤作用,为CAR结构的优化改造和临床高效应用提供了科学依据.

    定点突变信号肽嵌合抗原受体CD19-CAR-T细胞体外杀瘤细胞因子

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    溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒在肿瘤中的复制及表达

    蔡奇应张思琪刘华鹃刘滨磊...
    585-595页
    查看更多>>摘要：本研究旨在检测 BALB/c 小鼠肿瘤注射部位溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒(oncolytic herpes simplex virus type 2,oHSV2)的持续时间和复制水平.同时检测血清中人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte macrophage colony-stimulating factor,hGM-CSF)的表达量和HSV-2 抗体水平.小鼠经瘤内注射高、低两个剂量oHSV2-Fluc[萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,Fluc)],检测其荧光表达变化及持续时间.采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)检测肿瘤组织中 oHSV2 基因拷贝数.酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中hGM-CSF表达量以及HSV-2 抗体水平.结果表明高剂量组肿瘤体积显著小于对照组(P<0.01).瘤内注射 oHSV2-Fluc 表明病毒携带的 Fluc 可以在肿瘤中持续表达,于第 11 天仍能检测到荧光,直至第 18 天低于检测线.通过提取肿瘤组织RNA进行 qPCR,表明第 9 天高、低剂量组肿瘤组织均存在 oHSV2 的 mRNA.对血清进行 ELISA 检测,相较于对照组,高、低剂量组 hGM-CSF 及 HSV2 抗体水平显著提高(P<0.05).这些发现表明,oHSV2 能够在瘤内正常复制,同时所携带的外源因子可持续表达,对肿瘤产生杀伤作用.瘤内注射oHSV2 后,小鼠血清中存在较高水平的hGM-CSF和HSV-2 抗体.

    溶瘤病毒持续时间肿瘤人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

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