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期刊信息/Journal information
中国动物传染病学报
中国农业科学院上海兽医研究所
中国动物传染病学报

中国农业科学院上海兽医研究所

黄光志

双月刊

1674-6422

bianjibu@shvri.ac.cn

021-34293142

200241

上海市闵行区紫月路518号

中国动物传染病学报/Journal Chinese Journal of Veterinary Parasitology北大核心CSTPCD
查看更多>>本刊是由农业部中国农科院上海家畜寄生虫病研究所主办，农业部农业预防办公室协办的全国唯一的兽医寄生虫学专业杂志。
正式出版
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    猪肺炎支原体LAP的结构预测及其抑制剂Bestatin对支原体生长的影响

    陈蓉郝飞谢星赵琳...
    1-11页
    查看更多>>摘要：本研究旨在以猪肺炎支原体为代表，研究支原体LAP酶活中心的高级结构及其被抑制后对支原生长的影响。亮氨酸氨肽酶(LAP)是一类广泛存在于各类生物的氨基酸代谢酶，有研究表明病原微生物的LAP酶活中心被抑制后可以直接影响微生物的代谢和生长。本研究拟以猪肺炎支原体(Mhp)LAP为模型，研究其理化特性和高级结构，探索LAP抑制剂乌苯美司(Bestatin)对支原体生长的影响。本研究首先用Clustal Omega进行序列同源性比较，分析LAP活性位点在不同支原体中的保守情况。然后采用GST融合标签表达猪肺炎支原体LAP蛋白，通过GST亲和层析和分子筛层析纯化蛋白，圆二色谱测定LAP的二级结构，用Alpha fold 2预测三级结构。最后用Bestatin与猪、鸡、羊等不同种属的支原体共培养来观察其影响。结果表明虽然总体序列同源性不高，但是LAP酶活中心的关键位点在常见支原体相对保守。猪肺炎支原体LAP可以通过GST标签进行可溶性表达。酶切GST标签后，分子筛层析显示LAP是六聚体，圆二色谱表明LAP具有正确的二级结构。预测的LAP三级结构显示其具有保守的底物结合关键位点。Bestatin对不同种属支原体的生长均产生抑制，且呈现剂量依赖性，但在不同菌株间存在差异，最低在6 μg/mL的浓度可通过抑制氨肽酶的活性抑制猪肺炎支原体的生长。该研究为新一代抗菌药物的研发提供了新的思路。

    猪肺炎支原体亮氨酸氨肽酶结构活性位点

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    四种藏兽医药用植物和屎肠球菌联用对大肠杆菌E6生物被膜的影响

    谭敏杨丹娇汪露黄志宏...
    12-20页
    查看更多>>摘要：采用改良结晶紫半定量法和微量肉汤稀释法分别对152株大肠杆菌进行生物被膜形成能力分析和12种常用抗菌药物敏感性试验。同时，利用棋盘稀释法评价四种藏兽医药用植物(马蹄黄、偏翅唐松草、华丽龙胆和岩生忍冬)不同提取部位(甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和石油醚)、屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗生素(氯霉素、土霉素、氨苄西林和磺胺甲噁唑)联合对10株多重耐药大肠杆菌(E1-E10)杀菌活性，以探讨不同药物组合对E6生物被膜的清除作用。实验结果显示:152株大肠杆菌多表现为中等成膜能力和无成膜能力表型，对氯霉素、磺胺二甲嘧啶、土霉素、氨苄西林、磺胺甲噁唑的耐药率均高于90％，对二氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、头孢噻呋、妥布霉素和头孢曲松的耐药率均低于50％，其中阿米卡星的敏感率最高，耐药率仅为19。90％;马蹄黄甲醇提取物、偏翅唐松草乙酸乙酯提取物、华丽龙胆甲醇提取物和岩生忍冬乙酸乙酯提取物、屎肠球菌S16和S17乙酸乙酯提取物对E1～E10的MIC范围分别为3。93～15。63、3。93～31。52，7。81～15。63、7。81～31。52、0。42～13。38和0。45～3。63 mg/mL;四种藏兽医药用植物不同提取部位和屎肠球菌乙酸乙酯提取物与高耐药率抗菌药物分别呈现不同的联合作用;在MIC浓度下，药物联合对E6表现出较强的生物被膜清除能力，其中岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取物与土霉素和氨苄西林联用对E6生物被膜的抑制率高于其他组合，岩生忍冬和偏翅唐松草乙酸乙酯提取部位与土霉素联用的抑制率分别为48。92％、42。58％，与氨苄西林联用的抑制率分别为48。58％、47。84％。选用的四种藏兽医药用植物、益生菌和抗菌药物联合应用在一定程度上能够解决本研究藏猪和藏鸡源大肠杆菌耐药性和生物被膜形成等问题。

    藏兽医药用植物生物被膜形成能力多重耐药性耐药谱型

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    Ⅰ群4型禽腺病毒Y17215-1株体外增殖规律及免疫原性研究

    李秀丽王利丽李富强田向学...
    21-26页
    查看更多>>摘要：为探讨禽腺病毒4型分离株Y17215-1的体外增殖特性和免疫原性，本研究以LMH细胞为模型，摸索Y17215-1株最佳接种剂量和收获时间;通过活毒滴鼻接种和灭活疫苗肌肉注射的方式免疫SPF鸡，测定其免疫原性。结果显示:Y17215-1株0。1 MOI接种LMH细胞，培养48～72 h病毒滴度达到峰值108。625 TCID50/mL。该病毒经肌肉注射对42日龄SPF鸡具有较强致病性，LD50为103。000 TCID50/0。2 mL。以107。676 TCID50的Y17215-1株滴鼻免疫21日龄SPF鸡，免疫后7 d 100％试验鸡产生中和抗体，14 d达到高峰。以Y17215-1株制备灭活疫苗肌肉注射免疫21日龄SPF鸡(107。676 TCID50/羽)，免疫后7 d 70％试验鸡产生中和抗体，21 d达到高峰。在免疫后21 d用1000LD50的Y17215-1株进行攻毒，活毒和灭活疫苗的保护率均为100％。以上结果表明:Y17215-1株具有很好的体外增殖特性和免疫原性，可以作为候选疫苗毒株。

    禽腺病毒4型LMH细胞增殖规律免疫原性

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    通过抑制caspase-8活性提高PRRSV体外培养滴度的初步研究

    钟华刘金凤陈冰覃绍敏...
    27-34页
    查看更多>>摘要：探讨通过凋亡抑制剂阻断PRRSV诱导的细胞凋亡来促进PRRSV体外复制，从而提高PRRSV体外培养滴度的可行性。本研究以PRRSV高致病毒株(HP-PRRSV)感染Marc-145细胞，并用三种凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK)分别处理PRRSV感染细胞，通过比较在不同的浓度、不同的作用时间处理下PRRSV培养滴度(TCID50)来筛选最佳抑制剂及其最佳使用浓度和作用时间。同时采用caspase-8活性蛋白酶检测试剂盒、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术等检测在最佳抑制剂作用下caspase-8活性、细胞凋亡及其通路相关因子表达情况。结果显示:z-IETD-FMK(caspases-8特异性抑制剂)为最佳抑制剂，10 μmol/L为最佳使用浓度，PRRSV感染细胞48 h后加入10 μmol/LZ-IETD-FMK能最大限度提高PRRSV体外培养滴度。此外，PRRSV感染Marc-145细胞后，细胞caspase-8活性显著增加，且随着感染时间的延长，细胞凋亡率及促凋亡因子Bax均呈上升趋势，而抑凋亡因子Bcl-2表达水平却呈下降趋势;用抑制剂z-IETD-FMK处理后，细胞caspases-8活性下调，细胞凋亡率也下降，Bax表达量显著低于不加抑制处理的病毒感染组(P＜0。01)，与此相反Bcl-2的表达水平为升高趋势，显著高于不加抑制处理的病毒感染组(P＜0。01)。说明，caspase-8特异性抑制剂能有效抑制PRRSV诱导的细胞凋亡。结果提示HP-PRRSV感染可通过caspase-8途径诱导Marc-145细胞凋亡，从而抑制病毒的复制。使用caspase-8特异性抑制剂可有效抑制细胞凋亡，进而提高病毒体外培养滴度。

    HP-PRRSVcaspase细胞凋亡活性检测

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    没食子酸抑制生物被膜机制的初步研究

    梁桂星张文婷汪最张腾飞...
    35-42页
    查看更多>>摘要：鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌是危害家禽养殖业和公共卫生的重要病原菌，生物被膜的形成是其持续和反复感染的重要原因。为探究没食子酸对二者生物被膜形成的影响，本研究采用微量稀释法测定没食子酸对鸡白痢沙门菌CVCC519和金黄色葡萄球菌ATCC 25923的最小抑菌浓度MIC、最小杀菌浓度MBC，共孵育测定最小生物被膜抑制浓度(MBIC)和最小生物被膜清除浓度(MBEC);采用结晶紫染色和硫酸-苯酚法分别测定其对试验菌生物被膜及胞外多糖(EPS)的抑制率，并利用环境扫描电镜观察生物被膜形态;最后采用qRT-PCR方法检测其对试验菌生物被膜形成相关基因表达量的影响。结果显示，没食子酸对CVCC519和ATCC 25923的MIC分别为4 mg/mL和8 mg/mL，MBC分别为8 mg/mL和 16mg/mL，MBIC均为8 mg/mL，MBEC均为16 mg/mL。此外，没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下，能有效抑制其生物被膜形成和EPS的产生。环境扫描电镜观察发现，没食子酸处理使生物被膜生成量显著减少，结构松散、变薄。qRT-PCR检测结果显示，没食子酸在不显著影响试验菌生长的浓度下，能显著抑制CVCC519菌毛基因csgA、csgD，纤维素基因bcsA、adrA，群体感应系统相关基因luxS的表达，而对ATCC 25923的ica操纵子和luxS并无显著调控作用。以上结果表明，没食子酸在不显著影响鸡白痢沙门菌生长的浓度下，可通过下调其生物被膜形成相关基因的表达，减少胞外基质的合成，产生抗生物被膜的作用;也能通过ica非依赖途径有效抑制金黄色葡萄球菌胞外多糖的分泌和生物被膜的形成。本研究为没食子酸防控鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌生物被膜提供理论基础。

    没食子酸生物被膜鸡白痢沙门菌金黄色葡萄球菌机制

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    稳转hTERT绵羊睾丸细胞系的建立

    杨雪任善会王相伟龚真莉...
    43-48页
    查看更多>>摘要：羊睾丸原代细胞的体外培养是探究牛羊病毒致病机理的重要材料，实际科研工作中常受困于此类细胞传代性差、性质不稳定等缺点。外源性导入人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)可以促使端粒酶活性的表达，延长细胞体外培养寿命是一种有效建立细胞永生化的方法。本试验中，通过RT-PCR获得hTERT。利用同源重组的技术，成功的构建了hTERT的真核表达质粒和慢病毒质粒。利用慢病毒表达系统，建立了稳转hTERT绵羊的睾丸细胞系。间接免疫荧光和蛋白免疫印迹试验研究结果均显示，hTERT基因已成功整合进入绵羊睾丸基因组中并稳定表达。第30代次的羊睾丸细胞生长较快，性状较稳定，表明已成功构建了具有永生化特性的绵羊睾丸细胞系，为草食动物病毒的相关研究提供重要的细胞模型。

    绵羊睾丸原代细胞人端粒酶逆转录酶基因hTERT永生化细胞系

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    表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺研究

    陈晓李伟国宋欢欢苏晓蕊...
    49-57页
    查看更多>>摘要：为建立一套表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒反应器工艺，提高反应器上猪瘟病毒E2蛋白的表达量，以商业化培养基为基础，通过对关键营养组分添加量的DOE试验设计优化，获得一种组合补料配方，并在3 L反应器上对补料方式进行优化，以最大限度提高细胞密度。进一步在反应器上摸索了通气策略，以精确调控猪瘟E2重组杆状病毒培养过程的营养代谢平衡，解决副产物乳酸和氨过度积累导致细胞活力下降的问题。首次使用半连续补料工艺与渗透压动态平衡相结合的补料策略以及定向调节通气的工艺模式，使猪瘟病毒E2蛋白的表达量由130 mg/L增加至520 mg/L，提高了3倍。将3 L反应器工艺在100 L反应器上进行了连续3个批次的验证，结果猪瘟病毒E2蛋白的表达量均大于500 mg/L，收获猪瘟E2蛋白制备的疫苗抗体均在2周后转阳，且抗体水平持续上升，接种后8周抗体阻断率仍维持在80％左右。综上，3 L反应器工艺能够稳定放大至100 L反应器，建立了表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒100 L反应器工艺，且100 L反应器上重组蛋白的表达量稳定、免疫原性良好。

    猪瘟病毒E2蛋白重组杆状病毒关键营养单元半连续补料定向调节

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    湖羊感染羊源性伪狂犬病病毒致病特征的研究

    齐新永王晓旭鞠厚斌赵洪进...
    58-64页
    查看更多>>摘要：为探讨羊源性伪狂犬病病毒分离株SH1407对湖羊的致病性。将7只健康湖羊随机分成试验组和对照组，其中试验组5只，对照组2只。用分离株SH1407对试验组湖羊进行人工攻毒，取发病死亡羊内脏组织用于组织病理学检查和免疫组化分析。湖羊在攻毒后3d开始出现症状，第4d症状进一步加剧，表现为局部奇痒、体温升高、精神沉郁、食欲废绝等症状，4只发病死亡，存活1只，死亡率达到80％。剖检主要表现为脑膜充血，肺淤血，轻度实变。病理组织学检查:大脑、延髓神经元变性，细胞核溶解、消失，呈病理性细胞凋亡;肺脏呈间质性肺炎病变;脾脏、肾脏出血。免疫组化染色显示，PRV在肝脏、肺脏、大脑、脾脏等组织器官广泛存在，病毒在肝脏中主要存在于库弗氏细胞中，在肺脏中主要存在于Ⅱ型肺泡细胞中，在脾脏中主要存在于巨噬细胞、单核细胞中，而在脑组织中，神经元呈现较强的信号，说明病毒主要存在于神经细胞中。实时荧光定量PCR测定内脏器官病毒载量，肝脏、脾脏、肺脏和脑组织中PRV大量增值，其中PRV在脑组织中大量增值导致中枢神经严重的病理改变。

    伪狂犬病病毒病理组织学免疫组化病毒载量

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    两株马立克病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析

    闫彩虹金文杰刘文博羊扬...
    65-72页
    查看更多>>摘要：为了解国内鸡群马立克病毒(MDV)流行毒株的分子特征，采用细胞培养法对马立克病疑似病鸡抗凝血进行MDV分离，间接荧光法鉴定MDV血清型，PCR扩增分离病毒的meq和pp38两个主要致病基因，所得序列与MDV参考毒株的序列进行比对分析。结果显示，共分离鉴定出2株MDVⅠ型毒株，分别命名为JS0316和JS0424。meq基因编码的氨基酸序列结果显示，2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征(A71S、P194-)，具有MDV强毒分离株的分子特征(D80Y、V115A、T139A、P176R和P217A)。同时，JS0316 Meq蛋白出现Q93R和V123A突变，pp38蛋白出现L98I和F240S突变，而JS0424 Meq蛋白出现P217T突变，pp38蛋白出现W67G和V210A突变。因此，2株MDV均具有国内流行强毒株的分子特征，同时存在新的基因突变。

    马立克病毒分离鉴定meqpp38序列分析

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    广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析

    郭长明陈怀君袁橙袁圣...
    73-82页
    查看更多>>摘要：本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性，为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。本研究于2019-2020年，从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。用PCR方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测，通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究，利用斑马鱼模型进行了致病性试验。结果显示:从261份病样中分离到35株无乳链球菌;血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ⅰa型;主要毒力基因的检测证明，cylE、sodA、gapC基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100％，而scpB只在人源参考菌株中检出;药敏试验结果发现，无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90％以上，对6种抗菌药耐药率为50％以上，分离株的耐药基因型和表型部分一致，无乳链球菌分离株均多重耐药，其中5重及以上耐药的菌株为27株，占总菌株数的77。1％;斑马鱼致病试验表明，无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性，为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。

    罗非鱼无乳链球菌分离鉴定生物学特性

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