查看更多>>摘要:目的 明确DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HVSMC)钙化过程中的作用.方法 将HVSMC培养分为对照组、模型组、共济失调毛细血管扩张突变激酶(iATM)组、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(iPARP)组,培养12d.茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测4组细胞钙化情况,彗星实验检测DNA损伤,Western blotting和免疫荧光方法检测组蛋白γH2AX磷酸化水平,酶联免疫吸附试验检测8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,NucleoCounter NC-3000TM高级细胞分析仪分析4组细胞的存活率.结果 光学显微镜和茜素红S染色发现第9天开始,与对照组相比,模型组出现细胞内钙质沉积,第12天钙质沉积明显.对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下Ca2+/蛋白比较,结果:①不同时间点Ca2+/蛋白有差异(F=168.970,P=0.000);②模型组与对照组Ca2+/蛋白有差异(F=203.040,P=0.000),模型组Ca2+/蛋白较高,钙化明显;③两组Ca2+/蛋白变化趋势有差异(F=13.213,P=0.000).培养12d时,茜素红S染色发现模型组比对照组钙化程度高,iATM组和iPARP组比模型组钙化程度低.σ-甲酚酞试验发现,iATM组和iPARP组Ca2+/蛋白低于模型组(P<0.05).彗星试验发现,对照组比较,模型组第9天开始出现更多数量的DNA受损细胞.对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下"彗星细胞"比较,结果:①不同时间点"彗星细胞"有差异(F=13.141,P=0.000);②模型组与对照组"彗星细胞"有差异(F=121.521,P=0.000),模型组"彗星细胞"百分比较高,DNA损伤明显;③模型组与对照组"彗星细胞"变化趋势有差异(F=89.290,P=0.000).模型组γH2AX蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05).对照组、模型组分别在第3和12天免疫荧光显微镜下观察>3个γH2AX病灶百分比,结果:①不同时间点>3个tH2AX病灶百分比有差异(F=168.970,P=0.000);②模型组与对照组>3个γH2AX病灶百分比有差异(F=203.040,P=0.000),模型组>3个γH2AX病灶百分比较高,DNA损伤明显;③模型组与对照组>3个γH2AX病灶百分比变化趋势有差异(F=153.410,P=0.000).模型组8-OHDG水平高于对照组(P<0.05).模型组细胞存活率低于对照组、iATM组、iPARP组(P<0.05);iATM组、iPARP组与对照组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05).结论 高Ca2+/P环境激活DNA损伤应答信号通路,诱导HVSMC坏死,进而形成钙化.