查看更多>>摘要:目的:研究机械牵拉对小鼠骨骼肌卫星细胞增殖和成骨成脂分化的影响并明确其作用机制.方法:本实验共分为两大部分,第一部分在未进行成骨及成脂诱导条件下进行,主要对细胞增殖活性和迁移能力进行评估,并检测机械牵拉对Wnt通路和Notch信号通路的影响,实验共分为五组:①空白对照组;②机械牵拉组;③溶媒对照组(二甲基亚砜(DMSO)+机械牵拉);④Notch抑制剂(KY-02111)+机械牵拉组;⑤Wnt抑制剂(FLI-06)+机械牵拉组.第二部分在进行成骨及成脂诱导条件下进行,实验共分为六组:①空白对照组;②诱导分化组;③诱导分化+机械牵拉组;④诱导分化+DMSO+机械牵拉组;⑤诱导分化+Notch通路抑制剂(KY-02111)+机械牵拉组;⑥诱导分化+Wnt通路抑制剂(FLI-06)+机械牵拉组.空白对照组小鼠骨骼肌卫星细胞不做处理,诱导分化组分别使用成骨或成脂诱导培养基培养细胞,诱导分化+机械牵拉组在细胞诱导培养的同时对细胞基底膜施加牵拉应力,诱导分化+Notch通路抑制剂(KY-02111)/Wnt通路抑制剂(FLI-06)+机械牵拉组在诱导培养和机械牵拉的同时分别向细胞培养液中添加终浓度为5μM的KY-02111或者FLI-06,诱导分化+DMSO+机械牵拉组向细胞培养液中添加与通路抑制剂等体积的DMSO作为溶媒对照.于培养后的第7和14天,CCK-8法检测细胞增殖活性.培养后的第14天,划线法检测各组细胞迁移能力;对细胞进行碱性磷酸酶和油红染色;通过实时荧光定量检测成骨分化标志基因碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子(Runx)-2以及成脂分化标志基因脂肪酸结合蛋白(FABP)4和脂蛋白脂肪酶(LPL)的mRNA表达变化;免疫印迹检测c-Myc和细胞周期蛋白B(CCNB)1蛋白表达.结果:(1)细胞增殖活性检测结果表明,与对照组比较,机械牵拉组骨骼肌卫星细胞的增殖活性明显增强(P<0.01);与机械牵拉组比较,Notch和Wnt通路抑制剂+机械牵拉组细胞增殖活性明显降低(P<0.01);(2)细胞迁移分析结果表明,与对照组比较,机械牵拉组骨骼肌卫星细胞的迁移能力明显增强(P<0.01);与机械牵拉组比较,Notch和Wnt通路抑制剂+机械牵拉组骨骼肌卫星细胞迁移明显减弱(P<0.01).(3)碱性磷酸酶和油红染色结果显示,与诱导分化组比较,诱导分化+机械牵拉组骨骼肌卫星细胞中ALP活性以及脂滴分泌明显降低;与诱导分化+机械牵拉组比较,诱导分化+Notch和Wnt通路抑制剂+机械牵拉组骨骼肌卫星细胞中ALP活性以及脂滴分泌明显增强;(4)实时荧光定量检测数据显示,与对照组比较,成骨诱导组骨骼肌卫星细胞中ALP和Runx-2 mRNA,成脂诱导组骨骼肌卫星细胞中FABP4和LPL mRNA表达均明显增强(P<0.05);与诱导组比较,诱导分化+机械牵拉组骨骼肌卫星细胞中上述基因表达明显减弱(P<0.05);与诱导分化+机械牵拉组比较,诱导分化+Notch和Wnt通路抑制剂+机械牵拉组细胞中上述基因mRNA表达明显增强(P<0.01);(5)免疫印迹检测结果表明,与对照组比较,机械牵拉组骨骼肌卫星细胞中c-Myc和CCNB1蛋白表达增加(P<0.01),与机械牵拉组比较,Notch和Wnt通路抑制+机械牵拉组骨骼肌卫星细胞中上述蛋白表达明显降低(P<0.01).结论:机械牵拉能够促进小鼠骨骼肌卫星细胞增殖和迁移,并抑制小鼠骨骼肌卫星细胞成骨和成脂分化,且其作用途径与细胞内Notch和Wnt通路的活化有关.