期刊,中国预防兽医学报 2024年卷2期_国家学术搜索

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期刊信息/Journal information

中国预防兽医学报

主　　编：孔宪刚

出版周期：月刊

国际刊号：1008-0589

电子邮箱：zgyfsyxb@vip.sina.com.cn

电　　话：0451-85935050 18946066050 18946066181

邮政编码：150001

地　　址：哈尔滨市南岗区马端街427号

中国预防兽医学报/Journal Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineCSCD北大核心CSTPCD

查看更多>>本刊是由国家科技部批准，农业部主管并委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所主办的国家级学术刊物，双月刊，国际标准大16开本，120页。刊号ISSN1008-0589，CN23-1417/S。本刊是中国自然科学核心期刊、中国期刊网入网期刊。中国科学引文数据库来源期刊，中国学术期刊评价数据库来源期刊。国内外公开发行。本刊始终坚持社会主义办刊方向，坚持“面向、依靠、攀高峰”方针，坚持理论与实践相结合，提高与普及相结合，以提高为主的办刊方针，大力提倡学术性、科学性、实用性、创新性、及时报道国内外预防兽医学方面的新进展、新成果、积极开展学术交流，为促进我国兽医科技事业的发展和畜禽疫病水平的提高，为加速科技成果的转化做出了重大贡献。

正式出版

收录年代

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域的原核表达与鉴定

林维鹏崔鹏飞王思文邓国华...

107-112,139页

查看更多>>摘要：A型流感病毒是一种重要的人畜共患病病原,严重威胁全球公共卫生安全.PB2蛋白的帽子结合结构域(CBD)在流感病毒的转录过程中发挥重要功能,是抗流感病毒药物的重要靶点之一.为获得高纯度原核表达的A型流感病毒的CBD蛋白,本研究利用同源重组策略将8×His标签与一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒的CBD区基因序列克隆至原核表达载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-8×His-CBD,经PCR及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经不同浓度IPTG诱导不同时间后,经SDS-PAGE检测蛋白表达后使用镍柱纯化.结果显示,菌体裂解上清中在21 ku处可见目的条带,与8×His-CBD蛋白预期大小符合,且以0.5 mmol/L IPTG于37℃诱导6 h时蛋白表达量最高,镍柱纯化后可获得纯度大于95%的8×His-CBD蛋白.为确定该蛋白是否具有生物学活性,本研究以帽子结构类似物m7GTP对其进行等温滴定量热试验,结果显示8×His-CBD蛋白和m7GTP结合时存在明显热峰,表明8×His-CBD蛋白具有生物学活性;经计算,其Kd值为1.71×10-5(±2.92×10-6)mol/L.本研究结果对流感病毒的基础研究和抗流感病毒药物的研发具有借鉴意义.

关键词：

A型流感病毒PB2蛋白帽子结合结构域原核表达纯化

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滑液囊支原体与鸡传染性支气管炎病毒共感染对SPF鸡的致病性研究

王晨燕邵国青侯博

113-120页

查看更多>>摘要：为比较滑液囊支原体(MS)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)共感染对SPF鸡的致病性,本研究将144只28日龄SPF鸡随机均分为阴性对照组、MS感染组、IBV-M41感染组、IBV-M41+MS共感染组、IBV-QX感染组、IBV-QX+MS共感染组共6组,采用50 μL/只剂量按相应分组点眼感染MS(106 CCU50)、IBV(105 EID50),阴性对照组以50 μL/只点眼KM2培养基(左眼)和PBS(右眼).感染后每天观察临床症状,在感染后7 d、14 d、21 d和28 d每组随机剖检6只鸡,观察气囊炎和气囊损伤评分,并采集气管进行病原再分离,其中MS经支原体液体培养基培养后进行PCR鉴定,IBV接种SPF鸡胚后进行RT-PCR鉴定.此外,各组鸡气管均经10%甲醛固定后进行粘膜厚度检测以及病理损伤评分.结果显示:除阴性对照组和MS感染组,其他组鸡在感染后4 d均出现一过性呼吸道症状.剖检结果显示MS感染组鸡在感染后21 d出现气囊炎,28 d仍可见气囊炎;而IBV-M41感染组和IBV-QX感染组鸡在感染后7 d或14 d出现气囊炎,且气囊炎的发生率均未超过50%.感染后14 d IBV-QX+MS共感染组鸡气囊炎发生率达100%(6/6),直至21 d并且大部分鸡气囊炎可持续至感染后28 d(5/6),而IBV-M41+MS共感染组鸡气囊炎仅可持续至感染后21 d,且气囊炎的发生率最高在感染后14 d(5/6).IBV-QX+MS共感染组鸡平均气囊损伤评分在感染后14 d、21d和28 d均极显著高于单一感染组(P<0.001),而IBV-M41+MS共感染组鸡仅在感染后14 d极显著高于单一感染组(P<0.001).病原再分离结果显示,各感染组鸡均在气管中再分离到MS(感染后28 d内)或IBV(感染后7 d内).病理损伤检测结果显示,共感染组鸡较各单一感染组鸡气管粘膜增厚持续时间更长以及病理损伤更为严重.IBV-M41+MS共感染组鸡在感染后14 d平均气管粘膜厚度显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.05),而在感染后21 d极显著低于IBV-QX+MS共感染组(P<0.001),其余各组鸡在感染后14 d和21 d均极显著低于IBV-QX+MS共感染组鸡(P<0.001).IBV M41+MS共感染组鸡最早14 d出现气管病变,而IBV QX+MS共感染组鸡在共感染后7 d就可见气管病理损伤,且共感染组鸡的平均气管损伤评分均极显著高于单一MS或IBV感染组(P<0.01或P<0.001).上述结果证实MS和IBV共感染较单一感染对28日龄SPF鸡的致病性更强,IBV M41或QX株与MS共感染对SPF鸡的致病性存在差异,本研究为临床IB和MS的防控提供科学参考依据.

关键词：

滑液囊支原体鸡传染性支气管炎病毒共感染致病性

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万方数据

广东鹅源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、耐药表型和耐药基因的检测及相关性分析

苏文楠杨智灿张美琳钟嘉诚...

121-127页

查看更多>>摘要：为了解广东地区鹅源多杀性巴氏杆菌(Pm)的流行情况、药物敏感性、耐药基因的携带情况以及耐药表型与耐药基因的相关性,本实验对2019年～2022年从广东地区采集的193份疑似感染Pm病鹅的心脏血液和肝脏组织划线接种于不同的培养基分离细菌,对分离菌纯化后采用PCR扩增分离菌的KMT1基因并测序,采用多重PCR扩增分离菌的5个荚膜基因及8个脂多糖基因,分析分离菌的荚膜分型与脂多糖(LPS)分型.结果显示分离到83株鹅源Pm,其中82株为荚膜A型,1株无法通过荚膜定型;LPS分型为L1型.采用K-B纸片扩散法检测分离菌的药物敏感性;通过PCR检测分离菌7类药物的15种耐药基因,包括β-内酰胺类(blaCTX-M、blaTEM、blaOXA)、氨基糖苷类(aadA1、aph(3')Ila)、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS)、酰胺醇类(floR)、四环素类(tetM、tetX)、大环内酯类(ermF、ereD)、磺胺类(sul1、sul3)耐药基因.采用统计学软件SPSS22中的完全随机设计两样本率的卡方检验分析分离菌的耐药表型和相应耐药基因的相关性.药敏试验结果显示,83株鹅源Pm对多种药物敏感性较高,其中对喹诺酮类的环丙沙星和氧氟沙星、氨基糖苷类的丁胺卡那和大观霉素、β-内酰胺类的头孢曲松、磺胺类的复方新诺明、大环内酯类的阿奇霉素敏感的菌株占比均在63%以上;对氨基糖苷类的链霉素和卡那霉素耐药的菌株占比高于50%,对氨基糖苷类的新霉素和四环素类的四环素耐药的菌株分别占49.40%(41/83)和46.99%(39/83).耐药基因的检测结果显示,分离菌检出耐药基因qnrB、sul3、blaTEM、aadA1、aph(3')Ila、ereD、ermF、tetM、floR,检出率分别为9.63%(8/94)、27.71%(23/83)、28.92%(24/83)、48.19%(40/83)、14.46%(12/83)、49.40%(41/83)、3.61%(3/83)、1.20%(1/83)、32.53%(27/83),未检出耐药基因qnrA、qnrS、sul1、tetX、blaCTX-M、blaOXA.相关性分析结果显示,aadA1基因与Pm对新霉素、链霉素、卡那霉素、大观霉素的耐药性具有极显著的相关性(P<0.001);blaCTX-M基因、floR基因分别与Pm对头孢拉定、氟苯尼考的耐药性具有显著相关性(P<0.05).上述结果表明,广东地区鹅源Pm主要为A∶L1基因型,对多种药物敏感,耐药基因携带率不高,部分药物的耐药表型与耐药基因具有相关性.本研究为广东地区鹅源Pm病的监测和防治提供参考依据,为Pm耐药机制的研究奠定基础.

关键词：

多杀性巴氏杆菌药物敏感性试验耐药基因

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鸭源马尿气球菌的鉴定及全基因组测序分析

张菡舒静超张晓静董青...

128-139页

查看更多>>摘要：为鉴定一株鸭源分离菌,并探究其生物信息学特性,本研究分别通过Pacbio Sequel三代测序技术和Illumina NovaSeq二代测序技术对该株鸭源分离菌进行全基因组测序;基于该分离菌16S rRNA基因序列构建进化树;通过GTDB基于基因组之间的平均核苷酸相似性及采用infer软件构建120个单拷贝基因序列进化树并对其分类;利用NR数据库比对分离菌全基因组蛋白编码基因序列;采用VFDB数据库分析该分离菌相关毒力基因;采用K-B纸片法测定分离菌对21种药物的药敏性试验;采用CARD数据库分析分离菌的耐药基因;利用GO、KEGG、COG数据库对分离菌进行基因功能、信号通路及基因的注释.测序结果显示分离菌由一个环形染色体和一个环形质粒组成,大小分别为2 133 811 bp和37 505 bp,GC含量分别为39.04%和35.03%;通过GTDB分类及NR数据库比对分析显示,该菌为马尿气球菌亚种;VFDB数据库比对发现6种致病毒力基因;药敏试验结果显示分离菌对红霉素、多西环素、庆大霉素、卡那霉素等多种药物耐药,CARD数据库比对发现6种耐药基因;基因功能分析显示,1 277 个基因参与 25类代谢通路,1 767个基因编码蛋白质,3 304 个基因与分子功能相关,1 977个基因与细胞组分相关,4 421个基因与生物学过程相关.本研究对鸭源分离菌进行全基因组测序及基因组结构、功能分析,丰富了鸭源马尿气球菌全基因组数据库资料,完善了该菌的系统进化信息,分析了其毒力因子和相关耐药基因,为后续对该菌株分子生物学特征、致病性和耐药基因筛选提供了基因组信息和基因资源.

关键词：

马尿气球菌全基因组序列耐药性致病性

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表达Strep-tag Ⅱ的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

史家宝蒙靓肖培宇范峻豪...

140-146页

查看更多>>摘要：为构建表达Strep-tag Ⅱ的重组塞内卡病毒(SVA),本研究在感染性cDNA克隆pSVA-I212V/S460L的基础上,采用重叠延伸PCR扩增Strep-tag Ⅱ并采用无缝克隆法将其插入SVA VP1基因C端,构建感染性cDNA克隆,命名为pSVA-Strep,并采用双酶切和测序鉴定正确后,将pSVA-Strep转染BHK-21细胞拯救重组病毒,收集病变细胞上清,并将含有病毒的细胞上清和野生型SVA(SVA-WT)分别感染BHK-21细胞,以未感染病毒的BHK-21细胞作为阴性对照,感染后24 h分别以鼠源SVA VP2蛋白单克隆抗体(MAb)5D10(1∶1 000)、鼠源Strep-tag Ⅱ MAb(1∶2 000)作为一抗,以FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶2 000)为二抗,采用间接免疫荧光试验(IFA)对重组病毒鉴定.IFA结果显示,以鼠源SVA VP2蛋白MAb 5D10为一抗,SVA-WT和重组病毒感染的细胞均出现绿色荧光,以Strep-tag Ⅱ MAb作为一抗时,仅有重组病毒感染的细胞出现绿色荧光,经SVA-WT感染的BHK-21细胞及阴性对照细胞均无绿色荧光,表明拯救了Strep-tag Ⅱ标记的重组病毒,并将其命名为rSVA-Strep.将rSVA-Strep在BHK-21细胞中连续传10代,每隔2代采用引物VP1-F/R经PCR鉴定并对第10代重组病毒的VP1基因测序以鉴定rSVA-Strep的遗传稳定性.结果显示,每隔两代的重组病毒经PCR扩增后均出现约780 bp的目的条带,第10代重组病毒扩增的VP1基因测序结果显示Strep-tag Ⅱ基因仍在重组病毒中,且无基因突变,表明rSVA-Strep的遗传稳定性较强;将SVA-WT和rSVA-Strep分别以MOI 0.01感染BHK-21细胞,在感染后4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h和72 h收获病毒测定病毒滴度并绘制生长曲线,结果显示在病毒感染36 h内rSVA-Strep和SVA-WT生长动力学基本一致,表明Strep-tag Ⅱ的引入在病毒感染36 h内对SVA的复制基本无影响.采用0.2%甲醛充分灭活rSVA-Strep,并利用Strep-Tactin® XT Purification纯化试剂盒纯化该灭活病毒,将rSVA-Strep灭活病毒上清加至Strep-Tactin亲和层析柱,分别用不同体积洗脱缓冲液依次洗脱病毒并通过western blot鉴定病毒的纯化效果.对纯化过程中不同洗脱液洗脱病毒的western blot结果显示,不同体积的洗脱液中E1、E2和E3均出现VP0和VP2两条带,且E1和E2的条带最明显,表明洗脱缓冲液的最佳洗脱体积约为2.2 CV;以上结果表明rSVA-Strep可通过Strep-Tactin亲和层析柱一步法纯化.本研究在SVA中插入Strep-tag Ⅱ标签,为SVA灭活疫苗的快速纯化提供技术手段,也为其他病原的快速纯化方法的建立提供参考.

关键词：

塞内卡病毒Strep-tagⅡ感染性克隆抗原纯化

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基于网络药理学和分子对接探究黄连解毒散治疗猪传染性胃肠炎的作用机制

银慧慧颜国庆赵武曾雪颜...

147-158页

查看更多>>摘要：为探究黄连解毒散(HLJDS)治疗猪传染性胃肠炎(TGE)的作用靶点及作用机制,本研究通过中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)检索HLJDS中的所有化学成分,以口服生物利用度(OB≥30%)、类药性(DL≥0.18)为条件筛选HLJDS的活性化合物及HLJDS活性化合物潜在靶点的数量和名称.利用Gene cards数据库和CTD数据库检索与筛选TGE的相关靶点和HLJDS作用于TGE的相关靶点.采用微生信在线Venn图制作工具分析HLJDS活性化合物和TGE的共同靶点.将上述数据采用Cytoscape 3.9.1软件构建中药-活性化合物-靶点的网络,其中度值>32的化合物可能是关键的化合物或者作用靶点.将HLJDS作用于TGE的相关靶点上传至STRING数据库,获得HLJDS作用于TGE的PPI网络.利用Cytoscape软件中的相关工具分析靶点的网络拓扑学参数,并通过这些参数筛选HLJDS作用于TGE的关键靶点.结果显示,从HLJDS共筛选到77个活性成分和825个药物作用靶点,并筛选到950个TGE相关靶点,其中HLJDS的活性成分与TGE交集的靶点有202个.中药-活性化合物-靶点的网络图结果显示,HLJDS通过77个有效活性化合物作用于202个HLJDS与TGE交集的靶点.PPI网络分析结果显示,肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子受体(EGFR)、一氧化氮合酶3(NOS3)、Toll样受体4(TLR4)与信号转导和转录活化因子3(STAT3)等31个靶点可能是HLJDS治疗TGE的关键靶点.通过DAVID数据库对HLJDS作用于TGE的相关靶点进行GO功能分析和KEGG信号通路富集分析.采用Auto Dock Vina 1.1.2将HLJDS度值前6的主要活性化合物PPI网络中前6的关键靶点进行分子对接并获得结合能.将度值前15的HLJDS活性化合物和关键靶点TLR4、TNF-α进行分子对接,通过结合能预测HLJDS活性化合物及对照化合物(姜黄素和维A酸)与TLR4、TNF-α的分子对接效果.GO功能和KEGG信号通路分析结果显示,HLJDS作用于TGE的相关靶点涉及生物过程333个、细胞组分51个、分子功能88个主要功能;涉及AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路和沙门氏菌感染等与TGE相关的信号通路.分子对接结果显示,HLJDS 6个主要活性化合物与6个关键核心靶点均能够自发结合.且相较于对照化合物姜黄素和维A酸,HLJDS中的黄藤素、黄连素、黄芩素和槲皮素等14个活性化合物与TLR4、TNF-α的结合能更低,结合效果更好.上述结果表明,HLJDS可通过多成分、多靶点、多信号通路作用于TGE的相关靶点,发挥治疗TGE的作用.本研究为HLJDS的进一步开发与应用提供研究基础与方向.

关键词：

黄连解毒散猪传染性胃肠炎网络药理学作用机制分子对接

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马病毒性动脉炎病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

梁歆歆王科珂蒋刚强徐军...

159-163页

查看更多>>摘要：为建立检测马病毒性动脉炎病毒(EAV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究针对EAV ORF7基因序列设计引物及探针,并对其反应体系进行优化,建立标准曲线,结果显示,EAV荧光定量RT-PCR方法在退火温度为61℃、引物和探针终浓度均为0.6 μmol/L的反应条件下效果最优;质粒标准品体外转录的cRNA在1.6×107拷贝/μL～1.6×102拷贝/μL时与Ct值之间呈现良好的线性关系,标准曲线方程为y=-2.68x+32.88,R2=0.9927,初步建立了EAV荧光定量RT-PCR方法.采用该方法检测EAV、马焦虫、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型、马流感病毒,结果显示,该方法仅能特异性检测到EAV,其他病原检测均为阴性,该方法特异性强;将体外转录合成的质粒标准品cRNA 10倍倍比稀释后利用该方法检测,结果显示该方法最低检测限为1.6×102拷贝/μL,灵敏性高;重复性试验结果显示,该方法组内及组间变异系数均小于2.0%,重复性好.采用本实验建立的荧光定量RT-PCR方法和文献发表的EAV荧光定量RT-PCR方法分别对234份临床样品进行检测,两者的阳性检出率均为14.1%(33/234),两种方法的符合率为100%.本研究建立的荧光定量RT-PCR检测方法为马病毒性动脉炎的防控提供了新的技术手段和思路.

关键词：

马病毒性动脉炎ORF7基因荧光定量RT-PCR

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水貂阿留申病毒的微滴式数字PCR方法的建立及初步应用

蔡晓庆姜世金张金叶孙圣福...

164-170页

查看更多>>摘要：为建立水貂阿留申病毒(AMDV)微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,本研究根据AMDV VP2基因的保守区设计特异性引物和探针,通过PCR扩增AMDV VP2基因并克隆至pMD19-T载体,构建重组质粒pMD19-T-AMDV,并经PCR和测序鉴定后利用该质粒标准品作为模板,通过各反应条件的优化,初步建立了检测AMDV的ddPCR方法.分别以AMDV、水貂肠炎细小病毒、犬瘟热病毒、犬细小病毒、水貂流感病毒基因组为模板,按照本研究建立的ddPCR方法检测,评估其特异性;将1.43×107拷贝/μL～1.43×100拷贝/μL的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR和文献中的荧光定量PCR(qPCR)检测,评估该方法的敏感性;分别以不同浓度的重组质粒标准品作为模板,采用优化后的ddPCR分别进行批内和批间重复性试验,以变异系数(CV)评估该方法的重复性.优化结果显示,该方法的最佳引物终浓度为400 nmol/L(1.2 μL)、探针终浓度为200 nmol/L(0.6 μL)、退火温度为60℃.特异性试验结果显示,该方法仅可检测到AMDV和质粒标准品,而其他相关病毒均为阴性结果.敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的检测限为1.43拷贝/μL,qPCR对质粒标准品的检测限为1.43×102拷贝/μL,前者比后者的敏感性高100倍.重复性试验结果,批内和批间重复性试验的变异系数均小于3%.对采集的70份病貂肝脏、脾、肾脏、环境拭子、肛拭子样品进行ddPCR和qPCR检测,结果显示,ddPCR对AMDV的检出率为24.28%(17/70);qPCR的检出率为15.7%(11/70),二者的阳性符合率为64.7%,阴性符合率为 89.83%,总符合率为91.42%.上述结果表明,本研究建立的ddPCR方法特异性强、敏感性高和重复性好,可以检测各种临床样品及含量极低样品中的AMDV,为AMDV早期感染的检测、流行病学调查及AMD的防控提供有力技术手段.

关键词：

微滴式数字PCR检测水貂阿留申病毒

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禽致病性大肠杆菌HlyE蛋白的免疫原性研究

张春晓王利丽赵奇孙欣艺...

171-177页

查看更多>>摘要：为评估禽致病性大肠杆菌(APEC)溶血素HlyE蛋白的免疫原性,本研究对APEC溶血素HlyE蛋白进行原核表达和纯化,并对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析,将纯化蛋白利用透析袋在4℃透析后,利用血琼脂平板对其溶血活性进行检测.SDS-PAGE和western blot结果显示,表达并纯化到分子量约为36 ku的重组HlyE蛋白(rHlyE),经ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定纯化后蛋白浓度为0.65 mg/mL;溶血活性检测结果显示,rHlyE具有溶血活性.以透析后的rHlyE作为抗原,按照50 μg/只的剂量免疫小鼠,对照组于相同时间点注射等量PBS,共免疫3次间隔14 d,并于首免后不同时间采血,采用间接ELISA方法检测两组小鼠血清特异性抗体水平,并于三免后18 d以2 LD50的APEC菌液攻毒小鼠,观察7 d内小鼠的死亡情况;于首免后28 d剖杀各组小鼠取其脾脏制备脾淋巴细胞,采用流式细胞术分别检测CD3+、CD4+、CD8+ T淋巴细胞亚型比率,对rHlyE的免疫原性进行评估.间接ELISA检测结果显示,该蛋白能够诱导机体产生体液免疫应答,分泌高表达量的IgG抗体,抗体水平于三免后15 d达到最高水平.rHlyE免疫攻毒保护试验结果显示,免疫组小鼠基本无明显临床症状,7 d内存活率达80%;而对照组小鼠表现明显临床症状,于攻毒后3 d内全部死亡.流式细胞术结果显示,与对照组相比,免疫组小鼠的CD3+、CD4+和CD8+ T淋巴细胞亚型比率均升高.上述结果表明,rHlyE在大肠杆菌BL21中为部分可溶性表达,将其免疫小鼠后可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫应答,并且可对小鼠产生较好的免疫保护效果.本研究明确了APEC HlyE蛋白的免疫原性,为APEC免疫保护蛋白的筛选以及疫苗研发提供了借鉴与参考.

关键词：

禽致病性大肠杆菌重组HlyE蛋白原核表达溶血活性免疫原性流式细胞术

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AIM2炎症复合体活化体系的体外构建及初步应用

许锦霞吴龙建胡燕萍孙敏捷...

178-184页

查看更多>>摘要：AIM2炎症复合体参与自身免疫性疾病和机体抵御病原体的过程,研究其激活机制具有重要的意义.为构建AIM2炎症复合体的体外活化体系,本研究通过PCR方法从人单核细胞(THP-1细胞)中扩增AIM2、ASC、pro-Caspase-1、pro-IL-1β基因片段后,构建重组质粒p3×Flag-AIM2、p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1和p3×Flag-pro-IL-1β,分别转染HEK293T细胞后采用western blot鉴定各蛋白的表达.结果显示,分别约在41.9 ku、34.1 ku、48.5 ku、24.6 ku处出现特异性条带,表明融合Flag标签的AIM2、ASC、Caspase-1和IL-1β蛋白在HEK293T细胞中获得了表达.除此之外,还可以在HEK293T细胞中检测到39 ku的内源性AIM2蛋白特异性条带,表明HEK293T细胞自身也表达内源性AIM2蛋白.将不同浓度比例的上述重组质粒转染或共转染HEK293T细胞,24 h后各组再转染poly(dA:dT),采用间接ELISA检测各组细胞中IL-1β的分泌水平.结果显示,空白对照组、p3×Flag-pro-IL-1β实验组和共转染p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-IL-1β实验组细胞上清中均未检测到IL-1β,共转染p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1、p3×Flag-pro-IL-1β和共转染p3×Flag-AIM2、p3×Flag-ASC、p3×Flag-pro-Caspase-1、p3×Flag-pro-IL-1β的实验组细胞上清中均能检测到高浓度的IL-1β,且共转染p3×Flag-AIM2的HEK293T细胞中IL-1β的分泌水平更高.此外,与对照组相比,poly(dA:dT)刺激后的各组HEK293T细胞中IL-1β的分泌水平极显著升高(P<0.001),表明AIM2炎症复合体的体外活化体系正确构建.将不同浓度的p3×Flag-AIM2与其它质粒共转染HEK293T细胞,并转染poly(dA:dT)作用,采用间接ELISA检测IL-1β的分泌水平,结果显示,无论是否转染poly(dA:dT),随着p3×Flag-AIM2的转染剂量的升高,IL-1β的分泌水平也显著或极显著升高(P<0.001、P<0.01、P<0.05、P<0.001),表明细胞中AIM2蛋白的表达量与AIM2炎症复合体的活性呈正相关.单核细胞增生性李斯特菌已被证实可以激活AIM2炎症复合体,利用该菌感染上述炎症复合体活化体系,6 h后采用LDH试剂盒检测各组细胞胞内细菌的存活情况.结果显示,细胞内单核细胞增生性李斯特菌的数量在感染2 h和 6 h极显著低于不转染质粒的对照组(P<0.001、P<0.01),表明构建的AIM2炎症复合体活化体系发挥了抗细菌感染的作用.综上所述,本研究正确构建了AIM2炎症复合体活化体系,并初步通过该活化体系证实AIM2炎症复合体具有抗细菌感染的功能,为后续研究该活化体系的具体作用机制奠定了基础.

关键词：

质粒构建AIM2炎症复合体IL-1β

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