查看更多>>摘要:目的 探究铜绿假单胞菌(PA)感染对肺血管内皮细胞功能的影响,并探讨其加重小鼠肺部炎症反应的可能机制.方法 PAO1 菌株感染人肺微血管内皮细胞HULEC-5a 2 h后,采用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测自噬相关基因5(ATG5)、6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)和钙黏蛋白5(CDH5)的mRNA表达,免疫荧光检测ATG5、PFKFB3 和血管内皮钙黏蛋白(VE-cadherin)的蛋白表达.采用小干扰RNA(siRNA)分别敲减ATG5、PFKFB3 后,RT-qPCR检测ATG5、PFKFB3 和CDH5 的mRNA表达,免疫荧光检测PFKFB3 和VE-cadherin的蛋白表达,并采用乳酸测定试剂盒检测细胞内乳酸的水平.采用PAO1 菌株感染小鼠后,肺组织切片病理染色观察小鼠肺部炎症,激光共聚焦显微镜观察并分析荧光标记的内皮细胞 PFKFB3 和 VE-cadherin 的表达量.结果 与对照组比较,PAO1 感染HULEC-5a细胞后,PFKFB3 mRNA和蛋白表达均增加(P均<0.05),CDH5 mRNA表达减少(P =0.023),VE-cadherin蛋白表达减少(P<0.001),且连续性被破坏,乳酸含量升高(P =0.017).与PAO1 感染HULEC-5a细胞比较,PAO1 感染敲减PFKFB3 的HULEC-5a细胞后,CDH5 mRNA表达增加(P =0.043),VE-cadherin荧光连续性得到恢复,乳酸含量降低(P =0.047);PAO1 感染敲减ATG5 的HULEC-5a细胞后,PFKFB3 mRNA(P =0.013)和蛋白表达(P =0.003)均增加,CDH5 mRNA(P =0.020)和VE-cadherin蛋白表达(P =0.001)均减少,乳酸含量升高(P =0.015).PAO1 感染小鼠后,病理HE染色结果显示,肺泡内明显的红细胞渗漏,炎症细胞浸润,肺泡间隔增宽和部分血管内皮细胞脱落.免疫荧光染色结果显示,与正常小鼠比较,PAO1 感染小鼠内皮细胞PFKFB3 表达增加,VE-cadherin荧光减弱,且不连续.结论 PA可能通过AGT5 调控PFKFB3 通路,破坏肺血管内皮细胞功能,进而加重小鼠肺部炎症反应.