查看更多>>摘要：目的 构建微流控器官芯片,并评估其在模拟骨关节炎进程中软骨下骨骨重塑的能力.方法 基于微流控技术和细胞共培养技术设计芯片主体,MC3T3-E1细胞贴壁培养在细胞接种小室的内部,在细胞接种小室的底部以0.5 ml/min的流速灌流培养基.评价指标:(1)微流控器官芯片的评价:灌流生长培养基,采用模拟仿真实验测试不同时间点细胞接种小室内部和底部液体的浓度差和平衡时间;活死染色观察细胞在设定流速下连续培养3、7 d的生物相容性,分为3 d组和7 d组.(2)微流控器官芯片的促成骨作用:灌流成骨诱导培养基,通过碱性磷酸酶(ALP)染色和PCR比较细胞在静态和灌流条件下3、7 d的黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因成骨特异性转录因子2(RUNX2)、I型胶原(COL1A1)、骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、骨钙素(OCN)的表达情况,分为静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组.(3)三种成骨细胞亚型外泌体(EVs)的形态和大小表征及生物相容性:获取三种不同细胞亚型[内皮型成骨细胞(EnOB)-EVs、基质型成骨细胞(StOB)-EVs和矿化型成骨细胞(MinOB)-EVs],通过透射电镜和粒径分析获取形态和大小;灌流含有三种不同细胞亚型EVs的生长培养基,通过细胞增殖/凋亡检测实验比较添加不同EVs浓度(1、1.25、2.5、5μg/ml)24h的生物相容性,分为EnOB-EVs组、StOB-EVs组、MinOB-EVs组.(4)三种成骨细胞亚型EVs的促成骨作用:灌流含有三种不同细胞亚型EVs的成骨诱导培养基3 d,通过ALP染色和PCR比较黑色ALP阳性细胞数量和成骨相关标志基因RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN的表达情况,分为无EVs组、EnOB-EVs组、StOB-EVs组和MinOB-EVs组.结果 (1)微流控器官芯片的评价:模拟仿真结果显示,在持续灌流12 h后,上室最上层浓度达到下室浓度的95％以上,最下层为下室浓度的96.5％左右,上下室的浓度差达到平衡状态.活死染色结果表明,芯片在0.5 ml/min的流速下,生物相容性好,灌流3、7 d细胞存活率分别为(99.48±0.12)％、(97.07±1.05)％(P＜0.01).(2)ALP染色结果显示,3 d时灌流诱导组黑色ALP阳性细胞最多,静态诱导组其次,静态未诱导组最少;7 d时静态诱导组黑色ALP阳性细胞最.多,灌流诱导组其次,静态未诱导组最少.PCR结果显示,3d时静态未诱导组RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为 1.00±0.03、1.00±0.12、1.00±0.01、1.00±0.02,静态诱导组分别为 1.80± 0.04、4.05±0.37、9.80±1.94、4.38±0.89,灌流诱导组分别为 2.45±0.23、5.48±0.42、91.50±4.56、10.82±4.96(P＜0.01).7 d时静态未诱导组RUNX2表达水平为1.00±0.01,静态诱导组为1.46± 0.46,灌流诱导组为1.11±0.08(P＞0.05);静态未诱导组COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为1.00± 0.03、1.00±0.13、1.00±0.09,静态诱导组分别为9.38±0.25、14.27±4.35、84.01±4.02,灌流诱导组分别为2.39±0.08、133.64±8.87、86.64±8.36(P＜0.01).3、7 d时静态未诱导组、静态诱导组和灌流诱导组相互比较,均为灌流诱导组的促成骨能力最强.(3)三种成骨细胞亚型EVs的形态和大小表征及生物相容性:透射电镜下EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs均为典型的茶托状形态.粒径分析结果显示,EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs 的大小分别为(91.3±14.7)nm、(106.0±16.0)nm、(68.1±10.7)nm.细胞增殖/凋亡检测结果显示,EnOB-EVs、StOB-EVs、MinOB-EVs的最佳给药浓度均为1.25 μg/ml.(4)微流控器官芯片对于三种EVs促成骨功能验证:ALP染色结果显示,无EVs组黑色ALP阳性细胞最少,添加EnOB-EVs组其次,StOB-EVs组再者,MinOB-EVs组最多.PCR结果显示,无EVs组RUNX2、COL1A1、BMP-2、OCN表达水平分别为 1.00±0.01、1.00±0.03、1.00±0.02、1.00±0.02,EnOB-EVs组分别为 1.95±0.11、6.78±2.04、7.99±0.57、6.93±3.83,StOB-EVs 组分别为 0.79±0.12、5.68±1.53、12.59±3.15、25.59±0.95,MinOB-EVs组分别为 0.68±0.10、4.36±0.69、18.75±3.21、34.74±3.98(P＜0.01).无EVs组、EnOB-EVs组、StOB-EVs组和MinOB-EVs组相互比较,MinOB-EVs组促成骨效果最明显.结论 基于微流控技术和细胞共培养技术所构建的微流控器官芯片能够维持MC3T3-E1细胞的正常生长、促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨诱导分化能力.不同时期的成骨细胞所释放的EVs具有促成骨作用,加速骨关节炎进程中软骨下骨骨重塑中骨硬化的现象.
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