查看更多>>摘要:目的 构建丝素蛋白(SF)、细菌纤维素(BCNR)、羟基磷灰石(HAp)复合骨再生支架并评价其促成骨活性的价值.方法 将HAp颗粒、BCNR和骨形态发生蛋白2(BMP2)依次加入SF水溶液中,搅拌均匀后倒入不同大小的模具,-25 ℃下处理24 h,冷冻成型,通过冻干机将复合支架冻干.将SF与BCNR不同质量比的复合支架设置为A组(2∶1)、B组(4∶1)、C组(6∶1),将未加入BMP2的无活性复合支架设置为D组.扫描电镜检测支架的表面形貌和孔隙结构;压汞仪检测支架的孔隙率;万能材料试验机压缩支架,获得应力-应变曲线,分析支架的压缩强度和杨氏模量.将永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)接种到A组、B组、C组及D组复合支架上.细胞接种4、8d后,细胞活/死染色检测各组活细胞和死细胞比例;细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞的增殖活性;碱性磷酸酶(ALP)染色检测各组染色阳性细胞;ALP活性检测观察各组细胞的ALP活性.选取15只雌性SD大鼠,构建大鼠肌袋异位成骨模型,植入不同SF与BCNR质量比的复合支架及未加入BMP2的无活性复合支架,分别为A'组(2∶1)、B'组(4∶1)、C'组(6∶1)和D'组,另设假手术组,每组3只.假手术组在切开皮肤、钝性分离股四头肌肌肉,于肌肉中形成肌袋后,仅缝合肌袋及皮肤,不植入支架,其他四组在肌袋内植入对应的支架,并缝合肌袋及皮肤.术后2、4周行X线片检查,观察各组骨形成情况.术后4周,收集植入的支架与组织复合物,进行病理组织切片、HE染色和Masson染色,观察各组成骨情况.另对组织切片进行免疫组化染色,观察各组成骨标志物Ⅰ型胶原蛋白(COL1)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况.结果 扫描电镜显示,相较于A组和C组,B组片层结构和微孔结构更加规则、均匀;孔隙率分析结果表明,B组和C组孔隙率分别为(89.752±1.866)%和(84.257±1.013)%,均高于A组的(81.171±1.268)%(P<0.05或0.01),而C组孔隙率低于B组(P<0.01).力学性能检测结果显示,B组和 C 组压缩强度分别为(0.373±0.009)MPa 和(0.403±0.017)MPa,均高于 A 组的(0.044±0.003)MPa(P<0.01),B组和C组杨氏模量分别为(7.413±0.094)MPa和(9.515±0.615)MPa,均高于A组的(1.881±0.036)MPa(P<0.01),而C组压缩强度和杨氏模量均高于B组(P<0.05或0.01).细胞活/死染色结果显示,细胞接种4 d后,B组死细胞明显少于A组、C组和D组;细胞接种8 d后,B组活细胞最多,死细胞最少.CCK-8实验结果显示,细胞接种4 d后,A组和B组细胞增殖活性分别为0.474±0.009 和 0.545±0.018,均高于 D 组的 0.394±0.016(P<0.01),C 组细胞增殖活性为 0.419±0.005,与D组差异无统计学意义(P>0.05),而A组和C组细胞增殖活性均低于B组(P<0.01);细胞接种8 d后,B组细胞增殖活性为1.290±0.021,高于D组的1.047±0.011(P<0.01),C组细胞增殖活性为0.794±0.032,低于D组(P<0.01),A组细胞增殖活性为1.086±0.020,与D组差异无统计学意义(P>0.05),而A组和C组细胞增殖活性均低于B组(P<0.01).ALP染色结果显示,细胞接种4、8d后,相较于D组,A组、B组和C组有更多的阳性细胞,B组阳性细胞多于A组和C组.ALP活性检测结果显示,细胞接种4d后,A组、B组和C组细胞ALP活性分别为1.399±0.071、1.934±0.011、1.565±0.034,均高于D组的0.082±0.003(P<0.01),而A组和C组细胞ALP活性均低于B组(P<0.01);细胞接种8 d后,A组、B组和C组细胞ALP活性分别为2.602±0.055、3.216±0.092、2.145±0.170,均高于D组的0.101±0.001(P<0.01),而A组和C组细胞ALP活性均低于B组(P<0.01).X线片检查结果显示,术后2周,假手术组、D'组、A'组和C'组均无明显骨形成,而B'组有明显骨形成;术后4周,A'组、B'组和C'组均有明显骨形成,B'组骨形成明显多于其他两组,而假手术组和D'组均无明显骨形成.HE染色和Masson染色结果显示,术后4周,B'组形成大量均匀分布的新生骨组织,而A'组和C'组只在局部有少量新生骨组织,D'组仅有部分组织长入,且无明显新生骨组织,B'组形成的新生骨组织的成熟度比A'组和C'组更高.免疫组化染色结果显示,B'组COL1和OPN阳性染色均较A'组和C'组更多.COL1和OPN表达强度分析结果显示,A'组、B'组和C'组COL1表达强度分别为2.822±0.384、22.810±2.435、12.480±0.912,OPN表达强度分别为 1.545±0.081、5.374±0.121、2.246±0.116,B'组和C'组COL1、OPN表达强度均高于A'组(P<0.01),而C'组COL1和OPN表达强度均低于B'组(P<0.01).结论 基于SF、BCNR和HAp成功构建复合骨再生支架,其中SF和BCNR质量比为4:1的复合支架具有均匀孔隙结构、高孔隙率、良好的力学性能和生物相容性、优异的体外促成骨性能,还具有优异的骨诱导性和骨传导性.