摘要
[目的]探究(S)-β-没药烯合酶N端截短对其功能的影响.[方法]在截短处设计引物,引物引入限制性内切酶酶切位点,PCR产物经双酶切,连接到相应载体,经大肠杆菌Rosetta菌株表达,亲和层析纯化蛋白后蛋白酶切去融合标签,高分辨质谱测定蛋白分子量.体外催化产物经GC-FID/MS分析产物变化,Malachite Green无机磷酸含量法测定表观Kcat.[结果]截短10、20、30、40个氨基酸融合蛋白表达及纯化成功,GC-FID分析结果表明去标签的不同长度截短的酶催化主产物均为没药烯,显示活性没有丧失;随着N端截短氨基酸数目的增多,表观Kcat稍有变化.截短60个氨基酸的融合蛋白His-N60表达成功,但亲和层析失败,取表达的上清蛋白体外催化,结果显示无倍半萜合酶活性.[结论]N端截短40个氨基酸不影响其产物特异性和活性.此结果和其他报道不一致,显示不同的倍半萜合酶N端的作用可能不同.
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