摘要
为实现甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)在原核系统中高效表达,在GenBank上查找AFP全基因序列(GenBank登录号:NM 001134.2),分析AFP基因序列及大肠杆菌密码子偏好性优化,化学合成AFP全基因.以pET28 a(+)作为原核表达载体并转化至BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达.利用镍柱纯化AFP重组蛋白,并对纯化的AFP重组蛋白进行SDS-PAGE纯度分析、BCA蛋白浓度测定、Western-blot特异性鉴定.结果表明:AFP重组质粒经过Nde I、Xhol I双酶切鉴定,在1875 bp处出现特异性条带,与预期相符合;当诱导条件为30℃,0.1 mM的IPTG,诱导8 h,AFP重组蛋白可大量表达;BCA法测得AFP重组蛋白浓度达0.9239 mg/mL;纯化后的AFP重组蛋白与市售的AFP单抗进行Western blot鉴定,结果显示在75 kD处有明显的蛋白印迹,pET28a(+)/BL21(DE3)空白组无条带,表明AFP重组蛋白可在大肠杆菌中高效表达,且经Ni柱纯化后具有良好的特异性.研究实现了AFP重组蛋白在大肠杆菌中高效表达,为后续AFP的检测、以AFP为分子靶点的抗癌药物筛选奠定了基础.
基金项目
重庆市教委科学技术研究项目(KJZD-K201901101)
重庆理工大学研究生创新项目(ycx20192068)
重庆理工大学研究生创新项目(lgycx20202128)
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