本试验旨在筛选建立过氧化氢(H2O2)诱导的奶牛乳腺上皮细胞氧化应激模型的最佳条件,并探究竹叶黄酮(BLF)对奶牛乳腺上皮细胞氧化损伤的保护作用.以奶牛乳腺上皮细胞MAC-T细胞系为研究对象,将维持培养基中处理的MAC-T设为对照组,在维持培养基中添加不同浓度(200～1 000 μmol/L)H2O2处理的MAC-T设为氧化损伤组,在维持培养基中添加80 μg/mL BLF和800 μmol/L H2O2处理的MAC-T设为BLF预处理组.采用细胞增殖试剂盒(CCK-8)法检测细胞活力,采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞凋亡率,每次试验平行孔6个,重复试验3次.利用倒置荧光显微镜观察细胞内活性氧(ROS)含量的变化,利用试剂盒法检测细胞内抗氧化指标的变化,利用实时荧光定量PCR法检测细胞线粒体损伤相关基因表达的变化,利用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位(MMP)的变化.结果显示:1)600和800 μmol/L H2O2刺激细胞6和8 h符合建模条件,细胞活力为80.77％～72.81％,细胞凋亡率为20.79％～43.52％;2)与对照组相比,800 μmol/L H2O2刺激细胞8 h可显著提升ROS含量(P＜0.05),显著抑制过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性(P＜0.05);3)与对照组相比,800 μmol/L H2O2刺激细胞8 h对B淋巴细胞瘤/白血病-2(Bcl-2)的mRNA相对表达量无显著影响(P＞0.05),但可显著增加B淋巴细胞瘤/白血病-2相关X蛋白(Bax)的mRNA相对表达量(P＜0.05),并使Bax/Bcl-2比值显著增加(P＜0.05),同时显著增加MMP去极化细胞比例(P＜0.05);4)与氧化损伤组相比,80 μg/mL BLF预处理24 h能显著提高细胞活力(P＜0.05),显著降低ROS含量(P＜0.05),显著提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05),显著降低Bax的mRNA相对表达量(P＜0.05),显著提高Bcl-2的mRNA相对表达量(P＜0.05),使Bax/Bcl-2比值显著降低(P＜0.05).综上所述,本试验成功建立了H2O2诱导的MAC-T氧化应激模型,最佳条件为800 μmol/L H2O2处理8 ho BLF可以抑制H2O2诱导的MAC-T凋亡和ROS生成,缓解线粒体损伤并恢复抗氧化能力,保护MAC-T抵御H2O2诱导的氧化损伤.
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