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mtr-miR156a在奶牛乳腺上皮细胞的靶基因筛选鉴定及其调控奶牛乳蛋白生物合成的研究

Screening and Identification of Target Genes of mtr-miR156a in Bovine Mammary Gland Epithelial Cells and Its Regulation on Milk Protein Biosynthesis in Dairy Cows

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本试验旨在探究苜蓿miR156a(mtr-miR156a)在奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)的靶基因及其对乳蛋白合成的调控作用,为进一步研究外源性植物微小RNA(miRNA)调控奶牛乳蛋白合成提供研究基础.首先通过联川生物云平台、TargetScan和RNAhybrid在线网站预测和筛选出mtr-miR156a调控蛋白合成的候选靶基因,然后构建候选靶基因丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa调节亚基delta亚型(PPP2R5D)和磷酸肌醇3激酶调控亚单位2(PIK3R2)的重组质粒,并通过双荧光素酶验证鉴定出靶向基因,最后运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测过表达mtr-miR156a对BMECs乳蛋白合成相关基因表达以及酪蛋白编码基因mRNA和蛋白表达的影响.结果表明:1)双荧光素酶报告基因和qRT-PCR鉴定了mtr-miR156a可以靶向结合PPP2R5D和PIK3R2并极显著降低其表达水平(P＜0.01).2)与mimic NC相比,过表达mtr-miR156a极显著降低丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、核糖体蛋白S6激酶beta-1(S6K1)、真核翻译起始因子4B(eIF4B)、核糖体蛋白S6(RPS6)、结节性硬化症复合物亚基2(TSC2)、脑富集Ras同源物(RHEB)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和真核翻译起始因子4E(eIF4E)相对表达量(P＜0.01),极显著提高蛋白激酶B1(Akt1)和真核翻译起始因子4E结合蛋白1(EIF4EBP1)相对表达量(P＜0.01).3)与mimic NC处理相比,过表达mtr-miR156a极显著提高酪蛋白 alpha S1(CSN1S1)、酪蛋白 alpha S2(CSN1S2)、酪蛋白 beta(CSN2)和酪蛋白kappa(CSN3)相对表达量(P＜0.01).4)ELISA结果表明,与mimic NC处理相比,过表达mtr-miR156a显著提高BMECs培养液上清液中α酪蛋白和β酪蛋白含量(P＜0.05),极显著提高上清液中κ酪蛋白含量(P＜0.01).综上所述,mtr-miR156a通过靶向结合位于磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/mTOR信号通路的PPP2R5D和PIK3R2,调控 PI3K/Akt/mTOR 信号通路 PDK1、S6K1、eIF4B、RPS6、Akt1、TSC2、RHEB、mTOR、eIF4E 和EIF4EBP1等基因表达,上调BMECs中编码酪蛋白基因mRNA和蛋白表达水平,参与BMECs中酪蛋白的调控.

mtr-miR156aBMECsPPP2R5DPIK3R2cross-border regulationcasein

刘宝宝、贾晶莹、孟桂智、刘祖江、马云、蔡小艳

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宁夏大学农学院,银川 750021

宁夏回族自治区反刍动物分子细胞育种重点实验室,银川 750021

mtr-miR156a BMECs PPP2R5D PIK3R2 跨界调控 酪蛋白

国家自然科学基金宁夏科技厅优秀青年项目

319606802022AAC05012

2023

10.12418/CJAN2023.669

动物营养学报
中国畜牧兽医学会

动物营养学报

CSTPCDCSCD北大核心
影响因子：1.297
ISSN：1006-267X
年,卷(期)：2023.35(11)
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