[目的]对bPAG16基因进行优化和合成,构建proEM-bPAG16重组表达载体,将重组质粒转染至HEK293细胞中,获得bPAG16重组蛋白,为家畜早期妊娠诊断技术的研发提供技术支撑.[方法]通过生物学技术对bPAG16基因密码子进行优化和人工合成,经T4 DNA连接酶将bPAG16基因插入到proEM载体中,构建重组载体proEM-bPAG16,将其转染至HEK293细胞中进行瞬时表达,重组蛋白经Ni-IDA亲和柱纯化后,采用SDS-PAGE、Western Blot检测其表达效果.[结果]优化后的bPAG16基因密码子适用指数(CAI)由原来的0.77提高到0.96,GC含量由48％提高到58％.重组载体proEM-bPAG16双酶切后分别获得1179 bp和4369 bp的2条片段,与预期值一致;重组质粒测序结果显示,其核苷酸序列与优化后基因完全一致,氨基酸未发生突变;SDS-PAGE和Western Blot鉴定结果显示,获得重组蛋白bPAG16(rbPAG16)相对分子质量约48 kDa,经Ni-IDA亲和层析纯化后,其纯度达到90％以上.[结论]通过密码子优化策略及重组蛋白技术高效表达了rbPAG16,为奶牛早孕快速检测技术的研发奠定了基础.
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