Evaluation of Quantitative Phosphoproteomic Performance of Sequential Enrichment of Metal Oxide Affinity Chromatography for Phosphopeptides Using TMT 10-plex Isobaric Labeling
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探索并建立了一种快速、简便且高通量定量磷酸化蛋白质组的策略,即采用连续互补的磷酸化富集方法SMOAC(Sequential enrichment of metal oxide affinity chromatography)结合TMT(Tandem mass tag)标记技术定量磷酸化蛋白质组学.以3例经紫草素处理的及3例正常的人肝癌HepG2细胞为实验材料,经Trypsin酶解后的肽段用TMT10-plex试剂进行等量标记,标记肽段先经TiO2富集,收集包含磷酸化肽段的洗脱液,接着用次氮基三醋酸铁(Fe-NTA)对TiO2的流穿液和清洗液进行二次富集,再次收集包含磷酸化肽段的洗脱液.整个实验流程做2组,对其中一组的2次洗脱液分别分析,另一组的2次洗脱液合并分析.在SMOAC的2次洗脱液合并分析中鉴定到4263个磷酸化蛋白上超过13000条磷酸化肽,富集特异性>97％,其中被定量的磷酸化蛋白为3848个,占总鉴定量的90％以上.研究结果表明,SMOAC能够有效提高磷酸化肽段的鉴定效率,且能与TMT等量标记试剂结合,实现对少量蛋白样品的磷酸化蛋白定量分析.
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